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HLA基因分型方法：PCR－SSO（ASO）探针法
蚂蚁淘
/发布时间:1545759890 /浏览量:133
PCR－SSO（ASO）探针法 1）常规提取DNA 参见RFLP法 2）PCR扩增 参见PCR-RFLP法 3）斑点杂交 1．将5～20μl扩增产物，加变性液100～200μl室温处理5～15min。 2．在尼龙滤膜（预先用2×SSC浸湿2min）上真空点样，每孔以10×SSPE200μl冲洗，抽干，80℃干燥2h。 3．标记探针，取标记缓冲液2.5μl，寡核苷酸片段（dCTP,dGTP,dTTP）50～100ng，[γ-32P]ATP2.5μl，T4多核苷酸酶10U，双蒸水加至25μl，混匀，37℃保温45min，用0.5mol/LEDTA1μl终止反应，标记的探针可直接使用或采用柱层析分离标记好的探针。 4．点样膜于杂交前漂洗，放入杂交袋中，加入适量预杂交液2ml/10cm2在杂交温度下预杂交10～60min，将适量标记探针加入预杂交液中，杂交1h～过夜。 5．洗膜，2×SSPE和0.1％SDS于杂交温度洗2次，最后根据探针的Tm值调整洗膜2次。 6．－70℃放射自显影，用保鲜膜包好杂交膜，放入暗盒，加增感屏，再放置X线片，置低温冰箱，感光时间须摸索。
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