RFLP法

1）常规制备DNA

盐析法

1．用淋巴细胞分离液从抗凝血中分离出白细胞。

2．每3ml细胞悬液加10ml红细胞裂解液溶解红细胞两次，再加2ml白细胞裂解液溶解白细胞。

3．加50μl10％SDS和70μl蛋白酶K消化蛋白质，37℃过夜或55℃3h。

4．加0.25体积饱和醋酸钠溶液，剧烈摇动15s。

5．2000r/min离心15min，收集上清。

6．加入2.5倍预冷无水乙醇沉淀DNA，－20℃过夜。

7．吸取DNA团块用70％乙醇洗3次，每次10000r/min，10min。再溶于适量TE缓冲液中，4℃保存。

酚抽提法

1．采集EDTA抗凝血0.5ml，加双蒸水2.5ml，溶解红细胞。

2．离心10000r/min，5min，弃上清。

3．加0.5ml生理盐水，混匀，离心10000r/min，5min，弃上清。

4．加500μlTES，混匀，再加20％SDS25μl，蛋白酶K4μl置55℃水浴4h或37℃水浴过夜。

5．加等体积饱和酚，混匀，离心10000r/min，5min，吸取上层水相，再加等体积饱和酚抽提一次。

6．加等体积氯仿：异戊醇再抽提一次。

7．吸取上层液，加1/10体积醋酸钠，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃过夜，沉淀DNA。

8．吸出DNA团块，用预冷70％乙醇洗1次，弃尽液体，真空抽干DNA，加适量TE溶解。4℃保存。

2）限制性内切酶消化

在无菌EP管中依次加入双蒸去离子水7μl，10×缓冲液2μl，限制性内切酶1μl，DNA10μl。反应体系含1×缓冲液、DNA5μg、酶10U。稍离心以混匀，37℃水浴1～1.5h。酶解结束后向反应管中加1/10体积的终止液终止反应，冷却至4℃，准备电泳。

3）琼脂糖凝胶电泳

1．配制1％琼脂糖凝胶板：取0.4g琼脂糖加40mlTBE，微波炉熔化，加少量双蒸水补充蒸发的水分，将其冷却至60℃，倒入凝胶槽内，充分凝固后拔出样品梳。

2．从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入1×TBE，使其液面略高于琼脂糖板。

3．DNA样品按4：1的比例加样液，全部加样于琼脂糖板的样品孔中。

4．电泳80V，约2h。

5．取出凝胶板，置溴化乙锭溶液中染色30min。

6．紫外灯下观察结果，可用全色黑白胶卷拍照，镜头加红色滤色镜，光圈2，速度15～40s。

4）分子杂交

DNA转移

1．将琼脂糖凝胶切下，放入盛有变性液的搪瓷盘中，浸泡15～20min，用蒸馏水洗涤2～3次，用中和液再浸泡15～20min。

2．取一托盘放入10×SSC缓冲液，托盘上放一转移用支架，支架上搭滤纸桥，使溶液能够虹吸上来。

3．在支架上依次放入Whatman3MM滤纸，处理好的凝胶，硝酸纤维素膜，Whatman3MM滤纸，吸水纸，玻璃板，适量重物500～1000g。

4．放4℃冰箱转移12～16h，中间更换吸水纸。转移结束后，去除上面的东西，用镊子将膜取出，用清水冲洗一下后，让膜自然晾干。

5．80℃真空干燥2h，将DNA固定于膜上，保存于干燥处待用。

预杂交液

将转移好的硝酸纤维素膜用2×SSC溶液浸透，装入可加热封口的杂交袋中，按0.2ml/cm²加入适量预杂交液，用塑料热封口机封口。于37～42℃预杂交4～6h。

杂交

1．将塑料袋剪一小口，取出预杂交液。

2．将标记好的探针加热变性，煮沸7min，骤冷至0℃，加入杂交液。

3．将含探针的杂交液加入袋中，封口。

4．42℃水浴杂交20h，取出杂交液。

洗膜

1．1×SSC，0.1％SDS室温15min×2。

2．0.25×SSC，0.1％SDS室温15min×2。

放射自显影

1．洗涤后的膜置于干净的滤纸上，室温自然晾干。

2．用塑料薄膜包好膜，做好标记。

3．在暗室内将2张X线胶片放在增感屏的内侧，并将硝酸纤维素膜放在2张X线胶片之间。

4．盖严暗盒，放－50℃冰箱放射自显影2～7天。

5．在显影液中显影2～4min。

6．在定影液中定影20min。

7．用清水洗胶片20min，晾干，读片检测结果。