第一部分：单链CDNA的合成

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

去除RNA酶的双蒸水

10XRT-PCR缓冲液（100mmol/LTris-HCl、pH8.3,500mmol/LKC1，15mmol/LMgCl2)

2.酶和酶缓冲液

MMLV逆转录酶（100~200U/ul)

SUPERaseIN(20U/ul,Ambion)

3.核酸和寡核苷酸

dNTP混合物（10mmol/L,包含所有四种dNTP)

随机引物（50umol/L)

总RNA(1~5ug)

4.放射性复合物

竞争性RNA转录本，10⁹拷贝（见方案4)

5.实验器材

薄壁的PCR管

二、方法

1.在冰上向薄壁的PCR管中加2ul的50umol/L随机引物，一管用于RNA样品，一管用于竞争性RNA转录本。

2.加1~5ug总RNA到样品管（最大体积为10ul)。

3.加10⁹个拷贝的竞争性RNA转录本到相应管中（最大体积为10ul)。

4.在每管中加入4ul的10mmol/LdNTP混合物。

5.用去除RNA酶的双蒸水把体积增加到16ul。

6.70°C加热10min，变性二级结构，然后立即放在冰上。

7.加2ul的10XRT-PCR缓冲液。

8.加1ul的20U/ulSUPERaseIN。

9.加1ul的100~200U/ulMMLV逆转录酶。

10.42°C孵育lh。

11.95°C加热10min使逆转录踌失活。

12.继续进行扩增反应，或-20°C储存。

第二部分：PCR扩增

这一方案中PCR扩增的宗旨与相对RT-PCR中描绘的相同（见方案1)。方案设计包括6个反应及额外的10%份额。这对于一个样品用4个稀释浓度的竞争子、1个无竞争子的对照和1个无模板的对照是足够量的。

一、材料

1.缓冲液、溶液和试剂

去除RNA酶的双蒸水

10XRT-PCR缓冲液（100mmol/LTris-HCl、pH8.3，500mmol/LKC1，15mmol/LMgCl₂)

2.酶和酶缓冲液

TaqDNA聚合酶（5U/pl)

3.核酸和寡核苷酸

dNTP混合物（10mmol/L，包含所有四种dNTP)

基因特异的正向引物（5umol/L)

基因特异的反向引物（5umol/L)

来自上述反转录反应的cDNA

4.放射性复合物

竞争性RNA反转录反应物（未稀释=5X10⁷拷贝/ul)

薄壁的PCR管

6.专用仪器

可编程的PCR仪

二、方法

1.准备PCR反应混合物。

10XRT-PCR缓冲液35ul

10mmol/LdNTP混合物28ul

5umol/L基因特异的正向引物14ul

5umol/L基因特异的反向引物14ul

5U/ulTaqDNA聚合酶1.75ul

去除RNA酶的双蒸水236.25ul

2.平均在每个PCR管中加入47ulPCR反应混合物，共6管，分别标记1~6,在冰上操作。

3.加2ul准备好的模板cDNA到1~5号管中（见单链cDNA的合成）。

4.梯度稀释的反转录反应包含的竞争性RNA转录本如下。

未稀释：1ul反转录混合物=5X10⁷拷贝/ul

稀释10²倍：加1ul反转录混合物到99ul的TE缓冲液中=5X10⁵拷贝/ul

稀释10⁴倍：加1ul的稀释10²倍反转录混合物到99ul的TE缓冲液中=5X10³/ul

稀释10⁶倍：加lul的稀释10⁴倍反转录混合物到99ul的TE缓冲液中=5X10¹/ul

5.加1ul未稀释的竞争子到1号管中，对应5X10⁷拷贝/ul。

6.加1ul稀释10²的竞争子到2号管中，对应5X10⁵拷贝/ul。

7.加1ul稀释10⁴的竞争子到3号管中，对应5X10³拷贝/ul。

8.加1ul稀释10⁶的竞争子到4号管中，对应5Xl0¹拷贝/ul。

9.加1ul去除RNA酶的双蒸水到5号管中，作为无竞争子对照。

10.加3ul去除RNA酶的双蒸水到6号管中，作为无模板对照。

11.在适当的配有热盖的PCR仪（例如GeneAmpPCRSystem9700，AppliedBioSystems)上运行PCR扩增。扩增程序如下。

94°C30s

退火温度30s

72°C30s

30个循环

12.在含有1ul/ml溴化乙锭的2%~2.5%的琼脂糖凝胶上检验实验结果。每个反应上样5ul，结果以转录本的量和拷贝数来表示。由于设计时竞争子具有与目的基因同样的反应动力学，可以与目的基因共同扩增，而且在每个反应中样品和竞争子PCR产物的量可以直接比较。竞争子获得的PCR产物的强度与来自于内源RNA转录本的扩增相一致，同等强度代表RNA样品中存在的内源信息。竞争性定量RT-PCR实验的例子如图13-6。



13.为了对影响竞争子和外源转录本的反转录效率的变量进行控制，要做一个最终的RT-PCR实验，在这个实验中样品RNA和竞争子RNA在同一个管中被反转录。使用的竞争子RNA的量要接近于在初始RT-PCR实验中所提出的量，如前所述做反转录、扩增。如前所述，与内源信息产生同样信号强度的竞争子RNA的量代表了样品中内源信息的量。