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蛋白质的纯化实验一胶体过滤法
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/发布时间:1626802201 /浏览量:118
| 实验材料 | SephacrylS-300胶体 试剂、试剂盒 | 缓冲液bufferA-150 仪器、耗材 | 色析管柱铁夹试管铁架水平仪收集器浓缩用离心机 浓缩用离心管
实验步骤 | 一、仪器设备 色析管柱（PharmaciaCcolumn,1.6×100cm）、铁架、铁夹及水平仪；部分收集器（fractioncollector,需准备干净试管约100支）；浓缩用离心机（低速5,000rpm）；浓缩用离心管Centriprep-30（Amicon4322）请注意其使用方法。 二、药品试剂 胶体SephacrylS-300（Pharmacia）：a.预先以缓冲液bufferA-150平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。b.胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。c.Sephacryl系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15M以上的NaCl以除去非专一性吸附。BufferA-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合（Bio-Rad151-1901）：溶于1mL后每组取0.4mL.含有thyroglobulin（670kD），bovinegammaglobulin（158kD），chickenovalbumin（44kD），equinemyoglobin（17kD），vitaminB12（1350） 三、管柱装填 1. 以纯水冲洗玻璃管柱（以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以bufferA-150试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。 2. 依预估量取出Sephacryl胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡；将瓶中的胶体上下震荡，使的完全悬浮，但勿产生太多气泡。 3. 在管柱内加入约10cm高缓冲液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱，一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时，可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约90cm。 4. 胶体完全沈降后，小心以bufferA-150加满管柱，关闭出口，装上顶端端盖并连通缓冲液瓶，打开出口以重力流洗。调整缓冲液瓶高度，使流速约每五~六秒一滴，并设定收集体积为2.5mL/tube。 5. 胶柱流洗约100mL后，关闭出口，拆开顶端端盖，先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1cm高，注意勿破坏胶体表面平整；然后打开出口，使液面下降至胶体面，再关闭出口，准备注入样本。 四、样本色析进行 2. 打开出口，同时开启部分收集器；当样本完全没入胶体时，关闭出口，缓缓加入与样本相等体积的bufferA-150，打开出口待其慢慢进入胶体中，如此重复二次。不得扰动胶体表面，造成凹陷。 3. 暂时关闭出口，将液面高度加满至管柱顶端，并把顶端端盖锁上；然后打开出口开始溶离，调整缓冲液瓶的高度，使流速为6s一滴。 4. 要留心观察前面几个分划，确定整个系统运转无碍，小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜，收集约80管。 10）收集试管，进行蛋白质定量分析以及GUS活性测定，并请作图。 5. 收集GUS活性区，以Centriprep-30浓缩至10mL后，加bufferA-0稀释至20mL,再次浓缩至_______mL（GF），保留100μL。 6. 管柱请再以bufferA-150流洗100mL后，小心放置一旁，准备以后进行分子量测定。 五、分子量测定 1. 进行分子量测定前一天，请先以bufferA-150流洗100mL，并检查胶柱内有无气泡产生，若有严重的气泡或干裂，必须重新装填管柱。 2. 取标准分子量溶液0.4mL,加上纯质目标酶0.5mL（以亲和层析法所得的AF部份），如上法注入管柱中，立刻开始进行胶体过滤，并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。 3. 收集所得，进行蛋白质定量分析，可定出数个蛋白质尖峰，以作为分子量依据；另以目测法，决定红色高峰的管数，则可定出vitaminB12的溶离管数。利用以上数据，可画出分子量与溶离管数间的直线关系，作为分子量判定的标准校正线。 4. 同样的一批分划，请进行酶活性分析（GUS），则可定出酶的溶离体积，对照上述标准校正线，则可求出酶的分子量。 六、拆除管柱及保存胶体 1. 若管柱长期不用，应当自管柱中取出胶体，以缓冲液清洗后，置冷藏室中保存，但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧，有时可能不易取出，要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。 2. 胶体可以加0.01%NaN3防止霉菌生长，但使用前记得要洗去；再度使用时，请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒，若有结块而不易打散者，也不要使用。
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