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非肌肉肌动蛋白的纯化实验一非肌肉肌动蛋白的纯化
蚂蚁淘
/发布时间:1632072607 /浏览量:91
| 实验材料 | 非肌肉肌动蛋白 试剂、试剂盒 | DNA酶Ⅰ缓冲液 仪器、耗材 | DEAE柱
实验步骤 | 1.准备贮存液和材料。 2xDNA酶Ⅰ缓冲液： 20mmol/LTris-HCl，pH8.0 1mmol/LDTT 0.4mmol/LCaCI2 0.4mmol/LATP 抑蛋白酶肽 抑蛋白酶 亮抑蛋白酶肽 抑胃酶肽A PMSF TPCK 50%甲醛在DNA酶柱缓冲液中 0.4mol/LNH4CI在DNA酶Ⅰ缓冲液中 0.3mol/LKCl在DNA酶Ⅰ缓冲液中 DNA酶Ⅰ柱缓冲液 2.准备一个5~10ml的DNA酶Ⅰ的亲和柱。 3.准备一个0.2~1ml的DEAE柱：用DNA酶Ⅰ缓冲液平衡的DEAE-纤维素。 4.通过离心收集细胞并用等渗盐溶液（例如PBS)洗去培养液。 5.在加蛋白酶抑制剂的DNA酶柱缓冲液中重悬细胞沉淀物。 6.用对于感兴趣细胞的标准方法进行细胞匀浆。 7.用相差显微镜证实超过99%的细胞已经裂解了。 8.100000g离心裂解物45分钟。 9.用巴斯德吸管转移上清，避免混入脂肪。 10.柱子上样： (1)上清和用DNA酶Ⅰ缓冲液加蛋白酶抑制剂平衡了的DNA酶Ⅰ亲和介质混合，并把介质/蛋白混合物倒到一个小杆子中。 (2)在装填柱子时收集流出液，通过用抗肌动蛋白抗体进行的免疫印迹、DNA酶Ⅰ抑制分析或SDS-PAGE来证实有大量肌动蛋白留在柱子中。 11.用2倍体积含蛋白酶抑制剂的DNA酶柱缓冲液洗柱子，然后用含蛋白酶抑制剂和0.4mol/LNH4Cl的DNA酶柱缓冲液洗柱子。 12.用含50%甲醛的DNA酶Ⅰ柱缓冲液洗脱肌动蛋白。 13.立即把50%甲醛洗脱液上样到0.2~1mlDEAE柱子上。 14.用5倍体积的DNA酶Ⅰ柱缓冲液洗DEAE柱，然后用含0.3mol/LKCl的DNA酶Ⅰ柱缓冲液洗脱。分部收集，每管200μl。 15.检测收集液的蛋白浓度，然后混合出峰时的收集液。 16.加MgCl2使浓度为2mmol/L(这是选用于天然肌动蛋白），以使肌动蛋白聚合，用SDS-PAGE分析多肽组成。 产量应该是5%左右，所以从湿重10g的细胞指望得到2.5~5mg纯化了的肌动蛋白是合理的。
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