1.10mlIDA－Sepharose6B装填一个柱子。柱长与柱径比例可随目的蛋白结合的紧密程度不同而变化。结合较紧的目的蛋白用短而粗的柱子就能很好地分离；

2.3倍柱床体积的水洗柱；

3.3倍柱床体积的1mg/mlCuSO₄·5H₂O洗柱；

4.5倍柱床体积的层析缓冲液（20mmol/L，pH7.5磷酸钠盐缓冲液，0.5mol/LNaCl）洗柱；

5.用层析缓冲液处理蛋白质样品液，即用该缓冲液透析或1：1稀释。再经离心或过滤获得澄清的样品液。介质结合容量决定柱子的有效载样量，通过试验测定柱子的总结合容量是非常有用的。通常结合容量的合理估计是每ml介质结合10～100mg蛋白质；

6.将样品液（蛋白质浓度1～10mg/ml）上样到金属亲和柱；

7.5倍柱床体积层析缓冲液洗柱，或洗至A₂₈₀值回到甚线；

8.5倍柱床体积洗脱缓冲液（100mmol/L，pH5.0乙酸钠，0.5mol/LNaCl）洗脱目的蛋白；

9.含50mmol/LEDTA的层析缓冲液既可用于洗脱较强结合的蛋白质，也可用于柱子的再生。

另一个洗脱策略是金属结合竞争法，例如增加咪唑、组氨酸、甘氨酸或氯化铵的浓度，从而与目的蛋白竞争金属离子结合位点达到洗脱目的。促溶剂（脲）或去垢剂也有助于强结合蛋白质的洗脱。

浓度梯度洗脱也可试用来代替上面介绍的洗脱步骤。