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纯化非肌肉肌球蛋白实验一非肌肉肌球蛋白的层析纯化
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| 实验材料 | 非肌肉肌球蛋白 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | 匀浆缓冲液肌动蛋白聚合缓冲液凝胶过滤羟基磷灰石缓冲液GFHT缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 大容量转头 |
| 实验步骤 | 高速离心和DEAE层析 1.用不含除了PMSF以外的蛋白水解抑制剂的匀浆缓冲液平衡DEAE纤维素，取50ml装到2.5cmx35cm有合适管路的柱子上。 2.准备总体积为0.8L，线性梯度为0~0.5mol/LKCl的匀浆缓冲液。 3.用大容量转头（例如Ti647.5，它带6个70ml容量的聚碳酸酯桶）以43000r/min，137600g超速离心2小时，从已匀浆的细胞中沉淀细胞碎片。 4.尽可能多地转移清亮的上清，不要弄碎沉淀和浮在表面的白色脂肪残渣。 5.混合100ml上清和100mIDEAE-纤维素（已如上所述用匀浆缓冲液预先平衡）可以一次性地把清亮的上清样到DEAE上。DEAE-蛋白混合物倒进2.5cmx 35cm的预先装了50ml用匀浆缓冲液和PMSF平衡的DEAE-纤维素的柱子。 6.立即开始分部收集（每管8.5ml)。 7.用3~5倍体积的匀浆缓冲液洗柱子，用0.8~1升KCl梯度为0~0.5mol/L的匀浆缓冲液进行洗脱。 8.分析柱子中肌球蛋白的ATP酶活性（K+EDTA或Ca2+活性峰）、SDS-PAGE、免疫印迹、ELASA或放射标记及固相结合分析. 9.把从DEAE层析得到的含肌球蛋白的收集液混合在一起。 非肌肉肌球蛋白和外源肌肉肌动蛋白共沉淀 10.准备下列贮存液。 1mol/LKCl 0.1mol/LMgCl2 溶于不含ATP的肌动蛋白聚合缓冲液的30%蔗糖垫层： 300mg/ml蔗糖 50mmol/LKCl 2mmol/LMgCl2 10mmol/L嘧唑-HCl，pH7.0 11.计算所需的外源肌动蛋白量，使混合的DEAE收集液中肌动蛋白的终浓度为0.125mg/ml。所需肌动蛋白体积(ml)由下式给出： VA=(0.125xVpool）/[(肌动蛋白）-0.125] (肌动蛋白）是在缓冲液A中G-肌动蛋白贮存液的浓度，单位mg/ml。 12.量出所需G-肌动蛋白的量（使用1~8mg/ml溶于缓冲液A中的肌动蛋白，用肌动蛋白制备中所述的方法获得），并通过和适当体积的50x肌动蛋白聚合缓冲液（所加的体积=VA/50）混合并在室温培养10~20分钟来使它聚合。 50x肌动蛋白聚合缓冲液： 2.5mol/LKCl 1mol/LMgCl2 3mmol/LNaN3 13.F-肌动蛋白和DEAE收集液混合（步骤9)，使MgCl2浓度为2mmol/L。 14.加入足量的1mol/L葡萄糖使终浓度为50mmol/L(加50μl/ml)，然后加己糖激酶使终浓度为1单位/ml（0.25μl/ml）。室温下搅拌5分钟，然后转移到0℃过夜（几小时可能就足够了）。 15.在超速离心管中装1/3溶于不含ATP的肌动蛋白聚合缓冲液的30%蔗糖垫层，把含僵硬的肌动球蛋白复合物的样品铺到垫层上面。离心3小时沉淀肌动球蛋白。 通过不连续凝胶过滤从外源肌动蛋白中分离肌球蛋白 16.准备用于凝胶过滤的贮存液和材料 4x凝胶过滤/羟基磷灰石缓冲液： 200mmol/L咪唑-HCl，pH7.0 20%蔗糖 8mmoI/LK+EDTA，pH7.0 12mmol/LNaN3 可以贮存在4℃。 2xGF/HT缓冲液： 4XGF/HT缓冲液，100ml 0.1mol/LK+ATP，pH7.0，10ml DTT，62mg 用dH2O加到200ml。 KI凝胶过滤缓冲液： 2xGF/HT缓冲液，20ml Kl，4.78g 用dH2O加到40ml。 KCl凝胶过滤缓冲液： 2xCF/HT缓冲液，180ml KCl，16.10g 用dH2O加到360ml。 17.备一个1.5x85cm的用KCl凝胶过滤/羟基磷灰石缓冲液平衡了的A15-m琼脂糖凝胶过滤柱。 18.离心步骤结束的时候，在凝胶过滤柱上加12~19mlKI缓冲液。 19.倒掉上清和蔗糖，留下肌动球蛋白沉淀物，然后在冰库中把管子倒转在纸巾上5~10分钟，小心地使液体流干。用棉签去掉多余的液体。 20.处理沉淀： (1)用不锈钢刮刀挖出沉淀。 (2)在4.3mlKI缓冲液中用一个7ml的带紧的研杵的Dounce匀浆器进行匀浆。 (3)超速离心（50Ti转头，30000r/min63400g）30分钟使样品变清。 (4)仔细地转移上清，不要带任何沉淀碎片。 (5)立即把样品加到凝胶过滤柱上并用KCI凝胶过滤缓冲液跑柱子。 21.分析柱子中肌球蛋白的ATP酶活性、SDS-PAGE、免疫印迹、ELASA或放射标记及固相结合分析。混合含肌球蛋白的收集液。洗脱天然肌球蛋白-II的分配系数应该是0.13~0.14。 羟基磷灰石层析 22.准备进行羟基磷灰石层析的贮存液和材料。 预先在GF/HF缓冲液中平衡了的羟基磷灰石（2~4ml） 线性梯度，总体积20~40ml的GF/HF缓冲液，0~300mmol/LK+PO4，pH7.0 0.6mol/LK+PO4，pH7.0 23.准备一个1x5cm的有合适管路的柱子。 24.对收集液的进一步纯化是重复肌动蛋白亲和及凝胶过滤步骤或接着用经基磷灰石层析。 25.收集液和预先平衡好的羟基磷灰石（每毫升羟基磷灰石12~20ml收集液）混合在一起，然后旋转培养过夜（短一点时间可能也够）。 26.把蛋白/羟基磷灰石混合物倒到一个小柱子（1x5cm)中，用5~10倍体积的CF/HF缓冲液洗，然后用总体积20~40ml的GF/HF缓冲液，0~300mmol/LK+PO4线性梯度，pH7.0洗脱。肌球蛋白Ⅱ在大约200~220mmol/LK+PO4，pH7.0处洗脱下来。 |