一、流动相的配制

1.分别配制1L的洗脱液A(弱流动相）和洗脱液B(强流动相）。例如：

洗脱液A为0.1%TFA水溶液

洗脱液B为含0.09%TFA的60%乙腈水溶液要点：用于蛋白质测序的TFA，因其含有抗氧化剂而不适用于RPHPLC样品的洗脱。

有机溶剂和水必须分别用两个量筒来测量，然后再混匀，因为混合时体积将会减小，最多可减少3〇ml/L总体积（由溶剂的特性决定）。如果没有按正确方法配液，将会导致流动相成分比例的偏差。

实验提示：在用水和有机溶剂洗脱时，为补偿梯度洗脱中基线的变化(因为在短波长下，大多数有机溶剂吸收的光比水多），要降低洗脱液B中离子对试剂的量（TFA，H3P04)。与洗脱液A相比要降低10%~15%，从而产生平坦的基线（Dolan，1991)。

2.在容量瓶中，用Teflon包被的磁力转子搅拌将溶液混勻。

警告：在任何情况下都不能用封口膜封闭装有RP-HPLC洗脱液的长颈瓶或量筒。因为有机溶剂与洗脱液中酸性离子对试剂会溶解封口膜，使色谱出现非特异的峰。

3.用0.2ulPTFE过滤器先过滤洗脱液A，然后过滤洗脱液B。过滤洗脱液将会增加层析柱的使用寿命，有助于排出气泡。

4.用塞子塞紧装有洗脱液的瓶子，避免有机溶剂的挥发。

二、肽样品的制备

1.先用终体积的一半的洗脱液A溶解样品以达到所需浓度。如果样品不容易溶解，加入少量（<25%总体积）溶液B。

少量强流动相将造成样品的预洗脱，洗脱程度由样品环的大小、柱内径、流动相梯度的起始成分决定。

2.检验样品纯度，如果含有不溶的乳光物质或固体颗粒，则要用0.2)umPTFE过滤器过滤样品，或者离心后取上清液。

要点：如果样品未完全溶解就不能加样，否则会堵塞加样器和层析柱。

3.样品在不用时存放于4°C或-2°C，要依保存时间和使用情况而定。肽和蛋白质在室温下会发生降解。

要避免样品的反复冻融。将样品分装成小包装，一20°C保存，每次取出一次所用量。

三、RP-HPLC纯化固相合成的多肽

1.检测HPLC系统设备

以下的检测能评价柱床完整性[低完整性与峰的分裂、峰的前伸(fronting)或拖尾有关]和柱性能（根据塔板数），也能检测柱的寿命(如果以相同的间隔时间重复检测），并评估柱填充物批与批之间的差异。

（1）用空白对照进样（进洗脱液A)并用与多肽或蛋白质相同的洗脱梯度（100%A—100%B)进行洗脱，如果出现「鬼峰」（即假峰）就重复此操作。该步骤旨在清洗前次分离多肽和蛋白时可能遗留下的杂质。

（2）用硫脲或硝酸钠来测量柱的死体积（或用其他不会导致交叉影响的溶剂）。

（3）在合适的检测温度下采用梯度法来检测柱性能。例如采用下面的RP-HPLC测试混合物：

1.5g/L二甲基邻苯二甲酸

1.5g/L二乙基邻苯二甲酸

0.lg/L联苯

0.3g/L邻三联苯

3.2g/L邻苯二甲酸二辛酯（用甲醇溶解）

（4）通过梯度法和标准肽样品检测柱性能，如采用Mant和Hodgs(1991b)所描述的方法。

2.用RP-HPLC分析多肽粗制样

（1）在正式分析样品之前，要先在同样条件下至少做一组的空白对照。

如果出现峰，则重复该步骤。

（2）以分析型RP-HPLC的程序分离粗制样（约loo^g)。按以下信息框中列举的实验条件，根据纯度、色谱峰图、洗脱条件来评估样品。

（3）鉴定所要纯化的成分。

3.准备RP-HPLC

（1）按列出的实验条件，用制备型RP-HPLC程序来分离粗制肽混合物（约25?IOOmg)。

为避免检测器发生过载，一般用230?280nm的波长，但是在溶解粗制肽时，所加入的少量化学杂质（在SPPS步骤中使用）则会在该波长范围内有非常强的吸收。应先进行一次预分离并在214nm处检测，以确定主要肽产物的确切保留时间—虽然会有几微克的样品损失，但也是值得的。

（2）收集HPLC组分（3~7.5ml)。

4.进行分析性RP-HPLC

（1）用分析性RP-HPLC对所收集到的组分（30~50ul）进行分析。

分别对空白对照、粗制样溶液、目标组分及其前两个组分和后两个组分进行分析。

（2）通过比较纯化后成分的保留时间和粗制样中靶成分在色谱的保留时间，来确定收集到的含有在有效纯度范围内（即>95%)目的蛋白的组分。

（3）将得到的多肽定量分装在微量离心管中，一20°C保存，用于进一步研究。

5.进一步分析

（1）将纯度在95%以上的样品冻干。该纯度是通过分析型RP-HPLC分离、尚效毛细管电泳（HP-CZE)(Sitaram，etal，1999;Hearn，etal，2002)或毛细管电层析（HP-CEC)(Walhagen，etal，2000a，2000b，2001)或其他适当的高分辨率分析技术评估出来的。

（2）对最纯的组分进行离线（off-line)或在线（on-line)电喷雾离子化质谱（ESI-MS)分析，以确定合成的肽或蛋白是否正确，或者正确鉴别所要纯化的成分。

如果得到的样品质量与预期的不同，则有必要用ESI-MS再检测一下其他组分。