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免疫球蛋白纯化技术一Sepharose CL4B亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类
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| 实验方法原理 | 葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-SepharoseCL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。 |
|---|---|
| 实验材料 | SPA-SepharoseCL-4B |
| 试剂、试剂盒 | 磷酸缓冲液NaN3枸椽酸缓冲液Tris溶液再生缓冲液 |
| 仪器、耗材 | 玻璃柱 |
| 实验步骤 | 1. 用0.1MPH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-SepharoseCL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶（用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤） 2. 装柱后用0.1MPH8.0磷酸缓冲液平衡 3. 标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤。上样前用1MPH9.0Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜 4. 加样，一般按25～30mgIgG/g湿胶比例加样，室温作用15min,0.1MPH8.0磷酸缓冲液充分淋洗至淋洗液OD值为<0.02 5. 用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0；纯化IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1MPH3.0醋酸盐缓冲液或0.1MPH3.0Glycine-HCl缓冲液洗脱 6. 用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液 7. 收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定 |
| 注意事项 | 1. SPA-SepharoseCL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。 方法：先用10倍柱体积0.1MPH8.5Tris含0.5MNaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1MPH4.5醋酸钠缓冲液含0.5MNaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1MPH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。 2. SPA-SepharoseCL-4B亲和层析法还可用于 （1）除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体（如IgM）的生物学活性； （2）除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； （3）回收或纯化免疫复合物。 3. 狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。 |