一、标本制备和老化

1.用甲醇/冰乙酸固定的方法制备细胞悬液。

2.滴一滴细胞悬液于载玻片上，在染色体铺展所需的适宜温度（25°C)和湿度（45%?50%)条件下干燥标本。

3.用相差显微镜检测标本片的质量，在玻片上画出染色体分散良好或感兴趣的中期染色体区域。

4.在60°C烤箱中放置2h，老化当天制备的标本；或在60°C烤箱中烤1h老化室温过夜的片龄1d的标本片。将老化后的标本置于室温下，以备进行RxFISH的后续步骤。

5.标本在室温下的70%、85%和100%系列乙醇中各脱水2min，空气干燥。

二、变性和杂交用溶液的配制

1.配制70%乙醇，放于一20°C冰箱中。

2.配制50mL70%甲酰胺/2XSSC(pH7.5)放在72°C水浴锅中。

3.配制70%、85%和100%乙醇，室温保存。

4.准备湿盒，37°C预热。

三、探针变性

1.将装有RxFISH探针的离心管在37°C水浴中预热5min。

2.轻轻混匀，稍离心。

3.用无菌枪头按每张标本IOyL的探针量移液到0.5mL离心管，盖好管盖。

4.将不用的RxFISH探针放回一20°C。

5.65°C水浴中变性RxFISH探针lOmin。

6.将变性过的探针于37°C水浴中放置IOmin?2h备用。

四、标本变性

1.确保染色缸内的70%甲酰胺/2XSSC溶液温度为理想的72°C(见注释1和2)。

2.在70%甲酰胺/2XSSC溶液中变性标本（不超过4张）1.5min(见注释3)。

3.迅速将变性标本于一20°C冰冷的70%乙醇中淬灭（见注释4)。

4.将标本依次在室温条件下的70%、85%和100%系列乙醇中各脱水2min，空气干燥。

五、杂交

1.降低环境亮度，避免RxFISH探针光漂白（见注释5)。

2.取10uL变性探针混合物加在标本片上画出的杂交区域（含有分散良好的染色体或感兴趣的中期分裂相）。

3.缓慢盖上25mmX25mm盖玻片，避免产生气泡。

4.让探针溶液铺展到盖玻片的边缘，轻扣盖片，在不移动盖片的情况下排除气泡。

5.用橡皮泥封片。

6.37°C湿盒中孵育48h(见注释6)。

六、配制杂交后步骤所需溶液

1.配制150mL2XSSC溶液（pH7.0)，分装在3个染色缸中，放在45°C水浴锅中（见注释7)。

2.配制IOOmL50%甲酰胺/0.5XSSC溶液（pH7.0)，分装在2个染色缸中，放在45°C水浴锅中。

3.分装50mLpH7.5的4：XTween溶液（500mL4XSSC和0.25mLTween-20储存液）在1个染色缸中，放在45°C水浴锅中。

七、杂交后洗脱

1.用镊子小心除去橡皮泥，将标本放入第一缸的2XSSC中45°C孵育5min，滑落盖玻片（见注释8~10)。

2.在50%甲酰胺/0.5XSSC溶液中洗片5min，将标本转到下一缸同样溶液中，重复洗片5min。

3.在283(^溶液中洗标本51^11，将标本转到下一缸238(：溶液中洗5min04.将标本转到4XTween溶液中，45°C孵育IOmin。

八、抗体检测步骤（可选择的）

1.在上述的3.7中的第二次甲酰胺洗片的同时，室温条件下14OOOg离心两种检测FITC的抗体lOmin，只用上清进行下面的实验。

2.在小离心管中加入1ul兔抗FITC抗体和199uL4XTween溶液，轻轻混匀稀释液。室温避光孵育10min。

3.甩去标本上的多余液体。

4.向每张标本片加200ul兔抗FITC抗体1:200稀释液，37℃湿盒中孵育30min。

5.将水浴锅温度由45°C降至42°C，预热装有4XTween溶液的50mL染色缸，同时预热6次洗脱所需的250mL45XTween溶液。

6.检查以确保水浴锅和4XTween溶液温度为42°C。然后移去标本上的盖片，洗片5min。倒掉溶液，加入新鲜预热的4XTween溶液，再洗片5min。重复一次该步实验。

7.在洗脱的过程中，向另一离心管中加入2uLFITC标记的山羊抗兔IgG抗体和198juL4XTween溶液，轻轻混勻稀释液。室温避光孵育lOmin。

8.甩去标本上的多余液体。

9.向每张标本上加20(^LFITC标记的山羊抗兔IgG抗体1:100稀释液，37°C湿盒中孵育30min。

10.检查水浴锅和4XTween溶液温度为42°C，然后洗片3次，每次5min。

九、DAPI复染

将10UL复染剂和抗淬灭剂溶液加到标本上，并用盖玻片（22mmX22mm)封片（见注释11)。

十、图像捕获和分析

1.打开计算机，在研究菜单下选择RxFISH软件。打开软件后，选择捕获界面。开始图像捕获前，将滤色块轮设定到适合的顺序。捕获的探针信号保存在原始图像图层中，组合得到最终图像。Rx_Cy5信号最先捕获，随后依次是Rx-Cy3、Rx-FITC和Rx-DAPI。

2.用FITC进行中期扫描。FITC荧光信号不容易淬灭，所有的分析过程可以保持明亮。当找到一个中期后，在100X油镜头下聚焦，然后选择Rx-Cy5。

3.肉眼无法观察到Rx-Cy5,需要依赖计算机图像来了解详细信息。当曝光设定为5s时，应能够在黑暗背景下检测到微弱的白色图像。缓慢聚焦增加清晰度，因为在照相机和软件之间存在时间延迟。调节明暗直至得到好的对比度（约90%准确度）。针对不同的图像设置应略微调整。

4.点击「Live」按钮，滤色块轮将自动转到列表中的下一个荧光滤色块。大多数情况下其他的荧光信号曝光2s即可。一旦得到清晰带型的图像时，点击「Capture」按钮。

5.完成所有4个突光信号的捕获后，选择标记有「RxFISHImageCapture」的界面。在选择的界面内，完成整套图像的合成。保存所有的图像，即使有提示也不要删除，这些图像在分析中非常有用。

6.激活「Analysis」菜单，选择你想要分析的细胞。选择「Loadcell」将显示多色显带的染色体（见注释12)。在「AnalysisCustomize」菜单下，RxFISH图像也可显示为DAPI反转图像，可帮助识别染色体。「AnalysisProfile」工具用于显示每条染色体强度曲线。

7.用「Analysis」命令可分开染色体，只要一完成染色体分离，就可用「Classifier」和「Auto」命令产生细胞的核型。

注释

1.变性步骤是操作程序中非常关键的。变性时间和温度由标本的类型和片龄决定。每个实验者应根据自己需要确定适宜的温度和时间。一般在70~75°C温度范围和1.5?2min时间范围内能够得到好的结果。

2.整个实验过程中，应在使用前检查每个染色缸中的液体温度。通常染色缸中的液体温度比水浴锅的温度至少低TC。

3.每张室温标本放入72℃甲酰胺中将降低70%甲酰胺/2XSSC的溶液温度0.5~1°C;如果一次放人超过4张标本，70%甲酰胺/2XSSC的温度将不足以进行变性。

4.如果处理超过4张标本片，70%甲酰胺/2XSSC和第一缸70%乙醇必须调回它们的初始温度，即分别为72°C和一20°C。

5.Cy5荧光染料在红外波长范围内非常敏感，易被白光激发，因此在图像捕获过程中，应首先进行捕获，因为它将第一个淬灭掉的荧光。

6.标本在37°C湿盒中杂交12~96h。探针杂交时间不要少于12h，因为这会使信号強度将大大降低。杂交48h能够得到稳定的强信号，这是成功捕获图像所必需的。可根据各实验室的经验减少杂交时间。

7.为确保结果的质量，每天倒掉使用过的溶液。变性步骤中用的溶液不能储存起来用于杂交后洗脱步骤。

8.杂交后洗脱的步骤应在弱光的条件下完成，避免直接标记突光染料（Cy5和Cy3)光漂白。

9.在杂交后的所有实验步骤中，标本片不能干掉。

10.如果盖片不能从载片上滑下来，将标本片放于2XSSC中再次洗脱5min，再检查盖片是否滑落。

11.标本片在一20°C避光保存，以备拍照。

12.如果染色体彩色带型颜色比较淡，不够明亮，在比较暗的设置下（减少曝光时间）重新捕捉图像。在图像捕捉前调好焦距，缩短曝光时间以减少延迟。

照相机有个芯片收集荧光，然后将信息传递到计算机中，这就是为什么出现延迟的原因。DAPI图像不应该太暗，它为其他荧光颜色提供背景。如果DAPI图像不够亮，染色体看起来边缘参差不齐。由于同样的原因，调节好DAPI图像的焦距是很有必要的