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细菌基因组DNA提取实验一细菌基因组DNA试剂盒提取法
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| 实验方法原理 | 本试剂盒采用独特的细胞裂解和相分离技术，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到纯化基因组DNA的目的。适合于从1.0×109细菌中获得多至20μg的基因组DNA。用于PCR、Southern印迹分析、RAPD、RFLD等分子生物学实验。 |
|---|---|
| 实验材料 | 细菌培养物 |
| 试剂、试剂盒 | 细菌基因组DNA试剂盒 |
| 仪器、耗材 | DNA制备管小量滤器离心管 |
| 实验步骤 | 一、试剂盒组成、贮存、稳定性 1. 说明书，耗材：DNA制备管，小量滤器，2ml离心管，1.5ml离心管。 2. RNaseA：50mg/ml，室温保存。 3. 溶菌酶：50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50mg/ml，-20℃密闭贮存。 4. BufferS：细菌原生质制备液，加入RNaseA后，4℃密闭贮存。 5. 0.25MEDTA：室温密闭贮存。 6. BufferG-A：裂解液，室温密闭贮存。 7. BufferG-B：蛋白去除液，室温密闭贮存。 8. BufferDV-A：BufferDV的制备液，请参照实验准备BufferDV的配制方法配制，室温密闭贮存。 9. BufferDV：相分离液，室温密闭贮存。 10. BufferBV：DNA结合液，室温密闭贮存。 11. BufferW1：洗涤液，室温密闭贮存。 12. BufferW2concentrate：去盐液。使用前按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。 13. Eluent：2.5mMTris-HCl，pH8.5，室温密闭贮存。 二、实验准备 1.第一次使用时，在BufferW2中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。 2.准备BufferDV：取2mlBufferDV-A，125ml异丙醇，75ml异丁醇，加入提供的250ml试剂瓶中，混合均匀。 3.4℃预冷BufferDV。 4.第一次使用试剂盒时，用50%甘油溶解溶菌酶，使溶菌酶浓度为50mg/ml。 5.第一次使用试剂盒时将随试剂盒携带的RNaseA全部加入BufferS中，混合均匀。 6.准备65℃水浴。 7.检查BufferG-A和BufferG-B是否出现沉淀，若出现沉淀，于65℃水浴加热至沉淀完全溶解后再使用。 8.将Eluent或去离子水加热至65℃有利于基因组DNA的充分洗脱。 三、操作步骤 1.用2ml离心管收集1.0×109（1ml菌液OD600为1-1.5）的细菌培养物，12000×g离心30s，弃尽上清。用150μl已加入RNaseA的BufferS悬浮沉淀。 *确认RNaseA已加入BufferS中。 *悬浮需均匀，不应留有小的菌块，否则将影响溶菌效果。 2.加入20μl溶菌酶贮存液，混合均匀，室温静置5min。 3.加入30μl0.25MEDTA（pH8.0），混合均匀，冰浴5min。 4.加入450μlBufferG-A,旋涡振荡15s，65℃水浴10min。 5.加入400μlBufferG-B和1mlBufferDV（4℃预冷），用力混合，12000×g离心2min。 *请在实验前按照实验准备步骤2内容，准备BufferDV。 6.尽可能丢弃上相，保留相间沉淀和下相。加入1ml4℃预冷BufferDV，用力混合，12000×g离心2min。 7.丢弃上相，将下相转移至滤器（滤器置于2ml离心管中）。12000×g离心1min。 *上相无需完全弃尽，在转移无色下相时偶有混入的上相，可在Tip头内迅速分相，便于丢弃。 *如在转移过程中吸入少量界面沉淀，不必去除，可过滤除去。 *有色上相务必除尽，否则将抑制DNA结合到silica膜上。 8.弃滤器，在滤液中加入400μlBufferBV，混合均匀。 步骤9-12可选择离心法或负压法 A.负压法 9A.将制备管插到负压装置的插口上，将步骤8中的混合液移入制备管中，开启并调节负压至-20-30英寸汞柱，吸尽管中溶液。 10A.保持负压，加入500μlBufferW1，吸尽管中溶液。 11A.保持负压，沿管壁四周加入700μlBufferW2，吸尽管中溶液；以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。 *确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。 *沿管壁四周加入BufferW2有助于彻底冲洗沾附在管壁上的盐份。 *两次用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 12A.将制备管置于一个2ml离心管中，12000×g离心1min。 B.离心法 9B. 将制备管置于2ml离心管中，将步骤8中的混合液移入制备管中，12,000×g离心1min。 10B. 弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入500μlBufferW1，12000×g离心1min。 11B. 弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，加入700μlBufferW2，12000×g离心1min。 以同样的方法再用700μlBufferW2洗涤一次。 *确认在BufferW2concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。 *两次用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 12B．弃滤液，将制备管置回到原2ml离心管中，12000×g离心1min。 13.将制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加100-200μlEluent或去离子水，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱DNA。 *将去离子水或Eluent加热至65℃将提高洗脱效率。 |
| 注意事项 | 1. BufferG-B、BufferBV和BufferW1含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服、谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时，要立即用大量水或生理盐水冲洗，必要时寻求医疗咨询。 |
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