组织标本

方案12.6 冷胰蛋白酶解离组织

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实验方法原理剪碎的组织放在胰蛋白酶中于4°C放置16~18h,去除胰蛋白酶后温育并于温培养基中分散细胞。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.将组织(1~5g,预先称重)移入加有新配制的无菌DBSS的皮氏培养皿中,清洗。

2.转入另一培养皿中,切除多余组织如脂肪和坏死组织。

3.转入第三个培养皿中,用交叉的手术刀细切成大约3mm3的小块。胚胎的器官若小于3mm3,可全部保留。

4.用弯镊子将组织块移入一个预称重的15ml或50ml无菌离心管内。

5.让组织块沉降。

6.用DBSS重悬清洗组织块,沉降后去除上清,重复此步骤两次以上。

7.小心去除剩余液体,预先称重。

8.每克组织加入10ml溶于RPMI1640或S-MEM的0.25%胰蛋白酶(0.25粗制胰蛋白酶溶于无血清的RPMI1640或MEM/Stirrersalt(S~MEM)中),置于4°C。

9.4°C放置6~18h。

10.小心吸去胰蛋白酶,余下组织及残余胰蛋白酶(若需要,此时可加人1~2ml其他酶,如胶原酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶等)。

11.37°C放置20~30min。

12.加入温培养基,大约每100mg初始的组织加1ml,轻轻上下吸打混合物至组织完全分散开。

13.若部分组织未分散,细胞悬液可用无菌的平纹纱布或不锈钢筛(100~200μm),或一次性使用的塑料筛滤网过滤细胞,或者让大的组织块沉降。当有较多组织时,可于每克组织中多加入20ml培养基促进沉淀和随后的悬液收集,通常2~3min就足以去除大多数的大块组织。

14.用血球计数板或电子计数仪测定悬液的细胞密度,检査活细胞比率。

15.细胞群体为异源性,由于校准口径较困难,因而初次使用电子计数仪时,需要用血球计数板来确认。

16.将细胞悬液生长培养基(生长培养基(如DMEM/F12,含10%胎牛血清))稀释,使每毫升培养基含有1×106个细胞。按照需求接种于多个培养瓶(25cm2、75cm2培养瓶)中,大约每平方厘米为2×105个细胞。当存活率不明确或难以预知时,细胞计数便无价值(如肿瘤活检时,死亡细胞的比例很高)。在这种情况下,建议按每毫升5~25mg组织的浓度接种。

17.间隔一定时间更换一次培养基(2~4天,以pH下降为标准)。由于部分细胞黏附较慢甚至易于悬浮生长,所以丢弃上清前要先检査上清液中是否有存活的细胞。

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