实验二

热休克蛋白

HSP90

的

PCR

扩增技术

一、

实验目的与原理简介

聚合酶链式反应（

polymerasechainreaction

）是体外克隆基因的重要方

法，

它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。

因此能用于从微量样品中获

得目的基因，

同时完成了基因在体外的克隆，

是分子生物学及基因工程中极为有

用的研究手段。

常规

PCR

用于已知

DNA

序列的扩增，具体可分为三个主要过程：

一、

变性

。

通过升高温度使

DNA

双链模板分子中氢断裂，

形成单链

DNA

分子，

温度为

94

℃，时间

1min

。

二、

复性

。降低温度使

DNA

单链分子同引物结合。温度为

55

℃，时间

1min

。

三、

延伸

。

升高温度，

在

DNA

聚合酶最佳活性的条件下在引物

3

端加入

dNTP

，

实现模板的扩增，温度为

72

℃，时间

2min

。同时第一步变性前要在

94

℃下

预变性

5

分钟，使

DNA

双链完全解开。经过

25-35

个循环之后，在

72

℃下

继续延伸

10

分钟。

PCR

反应包含的七种基本成分：

1

）热稳定性

DNA

聚合酶：

TaqDNA

聚合酶是最常适用的酶，商品化

TaqDNA

酶的特异性活性约为

80000

单位

/mg.

2

）寡核苷酸引物：

寡核苷酸引物的设计是影响

PCR

扩增反应的效率与特异性

的关键因素。

3

）脱氧核苷三磷酸（

dNTP

）

：标准的

PCR

反应体系应包括

4

种等摩尔浓度的

脱氧核苷三磷酸，即

dATP

、

dTTP

、

dCTP

和

dGTP

。每种

dNTP

的浓度一般在

200-250

μ

l

之间，高浓度的

dNTP

对扩增反应会起抑制作用，可能是

dNTP

与

Mg

2+

螯合有关。

4

）二价阳离子：

一般需要

Mg

2+

来激活热稳定的

DNA

聚合酶，

由于

dNTP

与寡聚

核酸结

Mg

2+

合，

因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过

dNTP

和引物来源

的磷酸盐基团的摩尔浓度。

Mg

2+

的最佳浓度为

1.5mmol/L

。

5

）维持

PH

值的缓冲液：

用

Tris-Cl

在室温将

PCR

缓冲液的

PH

值调至

8.3-8.8

之间，标准

PCR

缓冲液浓度在

10mmol/L

。在

72

℃温育时，反应体系的温

度将下降

1

个多单位，致使缓冲液的

PH

值接近

7.2

。

6

）模板

DNA

：含有靶序列的模板

DNA

可以以单链或双链形式加入到

PCR

混合

液中，闭环

DNA

的及增效率略低于线性

DNA

。

实验目的：学习

PCR

反应的基本原理和基本技术。

二

、材料和试剂

10

Х

扩增缓冲液

4

种

dNTP

贮存液（

20mmol/L

，

PH8.0

）

TapDNA

聚合酶

5

端引物（

20

μ

mol/L

）及

3

端引物（

20

μ

mol/L

）

模板

DNA

琼脂糖凝胶

移液枪（

0.5-10

μ

L5-50

μ

L

）

枪头

实验操作

1

）

将

各成分加到微量离子管内混合：

1

0

Х

扩

增

缓

冲

液

2.

5

μ

l

5

端

引

物

1.

5

μ

l