1

取新鲜组织于

4%

多聚甲醛固定

24

小时

2

30%

蔗糖脱水

48

小时以上

3

-25

0

C

包埋（冰冻切片机内）

4

冰冻切片

冰冻切片步骤

1.

冰冻切片

4um

左右，室温

25

°

C

复温

30min

，浸入

4

°

C

预冷的丙酮固定

10min

，

2.

PBS

（

PH

为

7.2-7.4

）在

9cm

皿内摇床冲洗

3

次，每次

5min

（第一次冲洗时间短些，约

1min

后更换）

3.

用

30%

过氧化氢一份，

纯甲醇

50

份

（需要现配，

避光条件封闭，

可以用纸盒盖住皿）

30min

。

4.

PBS

（

PH

为

7.2-7.4

，酸性）在

9cm

皿内摇床冲洗

3

次，每次

5min

（第一次冲洗时间短

些，约

1min

后更换）

，甩去

PBS

，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周

围

画一适当大小的圈

，距离组织不宜太近，与切片组织保持

5mm

左右距离，太近会导致

边缘效应。

5.

5%BSA

，

室温孵育

20min

，

期间注意观察，

以免

BSA

干燥而导致背景太高，

玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。

6.

甩去血清，

PBS

洗

1min

，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓

度不均。

7.

配置一抗工作液用

5%BSA

（抗体浓度为

1:100

）

，

悬空加入一抗工作液

50-100ul

，

枪头不

要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否

则抗体可能附着不匀。

8.

放入湿盒内，置于

4

°

C

冰箱过夜（最长不可超过

48h

）

，注意盖盖，放入后观察玻片是

否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性）

，孵育

期间观察抗体是否干，若干了赶快用

PBS

清洗浸泡。

9.

第二天上午取出玻片，置常温

复温

30min

，后

PBS

冲洗

1+5+5+5min

，

10.

滴加

1:100

生物素标记的二抗

（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在

EP

管内弹

匀，掌上离心机离心）室温孵育

30min-1h

，后

PBS

冲洗

1+5+5+5min

。

11.

滴加

1:100

比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素

PBS

稀释液（

SABC

）

室温

1h

，

后

PBS

冲洗

1+5+5+5min

，甩干，以免显色不均。

12.

DAB

显色，显色时放置在白色纸上，观察显色程度以终止

DAB

反应，

最好把玻片置于显

微镜上找到可能的阳性显色区域滴加

DAB

，观察到阳性区和阴性区差异后终止

，此时最

好有计时，

以便于今后重复试验控制显色时间

（一般显色时间

2s-10min

，

显色时间过长

背景高，且可靠性低）

13.

终止

DAB

显色可将玻片置于染色缸内，

用自来水流水稀释终止

5min

，

后在显微镜下观察

是否有

DAB

颗粒附着。

14.

甩干水分，

苏木素

复染（如为加汞的苏木素，显色时间为

6-10s

，可不用酒精分化，直

接用

PBS

返蓝，如为非加汞苏木素，需在盐酸酒精分化）

，苏木素终止亦可用自来水冲

洗终止反应。

15.

水洗后梯度酒精脱水二甲苯透明

（

75%-85%-95%-100%-100%-

二甲苯

1-

二甲苯

2

）

个

3min

，

滴加

中性树胶

封片，中性树胶浓度以不拉丝为宜

16.

封片后干燥

1h(

或者在通风橱吹风的情况下

15min)

，

用棉球沾湿二甲苯擦去溢出的

树胶

。

观察照相。