间充质干细胞的分离培养与扩增

研究表明，除骨髓外，在外周血、脐血、脂肪、关节滑膜以及骨骼肌和皮肤的结缔组织等多种组织中均发现有MSC的存在。骨髓中MSC的含量很低，一般为0.001%〜0.01%，要利用MSC就必须实现其在体外的分离培养及扩增。目前，分离培养方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法。下面分别介绍几种适用于不同来源的人的MSC的分离纯化及扩增方法。

骨髓来源MSC的分离、纯化和扩增培养

1.材料与试剂
骨髓、低糖DMEM(DMEM-LG)、Percoll分离液、IOxPBS、IxPBS、MesenCult™培养液、肝素。

2.方法
(1)无菌条件下采集健康志愿者骨髓，肝素抗凝。

(2)用含10%胎牛血清的DMEM-LG培养液适当稀释样品，1500r/min离心5min,弃上清及脂肪层。

(3)加入5ml含10%胎牛血清的DMEM-LG培养液，混匀。

⑷按照I:1的比例将上述细胞悬液缓慢滴加到密度为l.〇73g/ml的Percoll分离液中，1500r/min离心30min。离心后管内容物分为3层。上层为血小板，中间层为Perc0Il分离液，底层为红细胞和多核白细胞。在上、中层液体界面处可见到乳白色云雾状的单个核细胞层。
1.073g/mlPercoll分离液配制方法：5.4mlPercoll原液、6mll〇xPBS。二者混匀后，吸弃300ul混合液。然后用IxPBS补齐至l〇ml，即为1.073g/mlPercoll分离液。

(5)吸取云雾状单个核细胞层，加人培养液稀释混匀，离心洗涤2遍。

(6)用MesenCult™培养液叹6111〇611(：〇.)重悬细胞，以2.(^10⁵个/〇112的细胞密度接种于培养瓶中，置于371、5%CO2、饱和湿度的孵箱内培养。

(7)48h后弃掉未贴壁细胞，更换新鲜培养液。

(8)以后每3天换液一次。

(9)细胞长到80%融合时，用0.25%的胰蛋白酶消化。

(10)按8xl〇³个/cm2的细胞密度传代进行扩增培养。

3.结果
用Percoll液(l.〇73g/ml)梯度离心从骨髓中分离单个核细胞，接种于MesenCult™培养液中，72h后出现散在的纺锤状贴壁细胞，1〇〜14天后形成克隆，MSC贴壁稀疏时，长梭形细胞的两极朝向不规律，细胞排列混乱，细胞之间往往通过突起相连接。约3周出现致密的贴壁细胞层，此时细胞的两极开始有规律地排列成束状(图4.6)，有的呈漩涡状。每瓶单层融合的MSC用胰蛋白酶消化后平均获得(5.5±0.17)XlO⁵个细胞，将这些细胞再传代培养，扩增I2代后可获得2.3xl〇⁹个细胞，扩增约4.6xl〇⁴倍。

4.注意事项

(1)在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSC外，还混杂着一些巨噬细胞、单核细胞、造血细胞及红细胞等，要得到较均一的MSC，必须除去其他细胞。根据这些污染细胞的特性，可采用不同的方式排除它们。对于红细胞，因其不贴壁，可通过换液除去;对于贴壁细胞，可根据其黏附能力与MSC黏附能力的不同，通过调整胰蛋白酶-EDTA的消化时间，保证MSC在短暂的时间内与培养皿底分离，而巨噬细胞、单核细胞、造血细胞等仍贴附于培养皿底，从而使MSC得到纯化。

⑵选择合适贴壁时间的细胞。如果选用贴壁时间过早的细胞(1〜3h)，则因贴壁细胞数量太少，使细胞生长困难；如果选用贴壁时间过长的细胞(超过48h)，在倒置显微镜下可见大量造血细胞黏附在贴壁细胞上呈集落生长，随着培养时间的延长，会出现贴壁细胞形态多样性，细胞传代周期延长，细胞易老化等现象。

(3)筛选最适于MSC生长的血清。首先血清的质量对于MSC的生长非常重要，一定要对不同批次的血清进行比较，筛选出最适合MSC生长的一个批次。本实验介绍的MesenCult™培养細卩是选用了经过筛选的适于MSC增殖的胎牛血清而配制的，通过传代培养后MSC的纯度可高达95%以上(一代和二代扩增培养后的MSC的表型一致性分
别达到95%和98%)。其次，血清的浓度也很重要，并非浓度越高越好，反而高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，易引起细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一般以5%〜10%胎牛血清最适合MSC生长。

(4)选择合适的接种密度。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一’般适宜密度为(4——8)xl〇⁴个/ml(艾国平等2001)。

脐带血来源的MSC的分离、纯化和扩增培养

脐血干细胞由于取材方便、来源广泛而备受关注。研究表明，来源于胳带血的单个核细胞培养后出现的贴壁细胞有两种表型，破骨样细胞和间充质样细胞(Linglingetal.2003)。破骨样细胞多核，表达TRAP、CD45、CD51/CD61;间充质样细胞呈成纤维样，表达SH2、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29、CD49e，这与骨髓MSC完全一致。以下就将脐带血MSC的体外分离、纯化、扩增方法做一介绍，为脐带血MSC的临床应用提供更充足的理论依据和技术方法。

1.材料与试剂
肝素、脐血、DMEM-LG、Ficoll-Hypaque分离液、甲基纤维素、IxPBS、MesenCult™培养液。

2.操作步骤

(1)无菌条件下采集肝素抗凝的正常人脐血50——100ml。

⑵与0.01mol/LpH7.4的PBS按I:1混匀。

⑶再按4:1的比例与0.5%的甲基纤维素混勻，室温静置30min以沉降红细胞。

(4)小心吸取上清，离心。

(5)弃上清，用PBS重悬细胞。

(6)叠加到密度为1.077g/ml的Ficoll-Hypaque溶液上，900g离心20min。

(7)取界面层，加入PBS混勻，离心洗涤。

(8)用MesenCult™培养液(StemCellCo.)重悬细胞，以I.OxIO6个/cm2的密度接种于培养瓶中，置于37℃、C025%、饱和湿度的孵箱内培养。

(9)1周后，更换培养基，弃掉未贴壁细胞。

(10)以后每3天换液1次。

(II)细胞长到80%融合时用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA混合液消化传代，在显微镜下控制消i七时间。

(12)以8.〇xl〇3个/cm2的细胞密度接种于传代培养瓶中以扩增培养。

3.结果
以Ficoll-Hypaque液梯度离心分离胳带血单个核细胞，接种于MesenCult™培养液中，一周后全量换液，去除未贴壁细胞。有的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞，有的脐带血样单个核细胞培养后出现间充质样细胞。破骨样细胞胞体较大，呈圆形，内含多个核(图4.7A)。间充质样细胞即为MSC，胞体呈梭形，最初散在存在，两周后形成包含有几十到几百个细胞的克隆，随着细胞的迅速增殖，3周后细胞生长达80%——90%融合，每个克隆约包含几百至几千个细胞，此时的MSC呈较均一的长梭形，形态类似于骨髓MSC，但较骨髓MSC稍小(图4.7B)。据统计，6.6xl〇⁵个脐带血原代MSC在体
外扩增10代后可获得9.9xl〇⁸个细胞，扩增约i.5xl〇³倍。

4.注意事项

(1)当前用于实验和临床的种子细胞主要为来源于骨髓的MSC，但其数量随着年龄的增长而明显下降。脐血源性MSC的优势在于：脐血从分娩后的胎盘、脐带残端收集，其过程比从骨髓或胚胎获取干细胞简单；对于新生儿及产妇均无任何痛苦和不良作用，易于接受；脐血受胎盘屏障的保护，其成分被病毒、细菌污染的概率低；由于脐血免疫系统的原始性，降低了移植后受体的排斥反应；脐血中含有的丰富干细胞，与人骨髓中数目相当，且更为原始，具有更强的分化能力；不涉及社会、伦理及法律方向的更多争论；收集的脐血不仅可作为异基因移植的供体，而且还可将其低温保存数十年，用于自体移植治疗相关疾病。

⑵与骨髓MSC相比，目前脐血来源的MSC仍存在数量少、频度低等问题。据统计约有1/4的脐带血样单个核细胞培养后出现MSC，3/4的脐带血样单个核细胞培养后出现破骨样细胞。因此，在体外培养过程中，如何消除破骨样细胞的存在，如何更好的对其进行纯化扩增，以获得稳定、均一的MSC仍是今后需努力探索的方向。

脂肪来源MSC的分离、纯化和扩增培养

近年来研究发现，脂肪组织中含有能分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞的前体细胞群，具有较强的增殖能力和多分化潜能，可称之为脂肪基质细胞或脂肪间充质干细胞(Patriciaetal.2001)。

1.材料与试剂

手术器械(大剪1把、止血榭2把、镊子2把、眼科镊子1把、眼科剪1把)，筛网(80目、200目、400目)，平皿2个，50ml离心管2个，IOml离心管2个。DMEM-LG，PBS，双抗，10%FBS,2%BSA，0.1%胶原酶，红细胞裂解液(0.154mol/LNH4OU10mmol/L•KHCO3、O.lmmol/LEDTA)。

2.方法

⑴将切取的人的脂肪组织放入平皿中，游离血管，用PBS冲洗，剪碎，加入4倍体积胶原酶、1倍体积BSA和双抗。

(2)置入50ml离心管，37°C消化45min，并不时摇动。

(3)将消化成糊状组织的脂肪组织先用80目筛网过滤，后用200目再过滤一遍，余下的脂肪组织加入胶原酶继续消化，重复上述操作。

(4)过滤液8〇〇g离心IOmin，去除上清，加入少许含血清培养液，用吸管轻轻吹打，使之成悬液。

(5)加入红细胞裂解液，室温放置IOmin

(6)1200r/min离心5min，PBS洗漆2遍。

(7)用DMEM=LG培养液(含10%FBS，100U/ml青霉素，lOOpg/ml链霉素湩悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5%C02、饱和湿度孵箱中培养。

(8)24h后更换培养液。

3.结果
体外培养的脂肪来源的MSC易扩增，并呈现成纤维细胞样形态，这与骨髓来源的MSC—致(图4.8)。

4.2.1.4MAPC的分离培养2002年，Jiang等从骨髓中分离纯化了一种更为原始的干细胞，称为多能成体祖细(multipotentadultProgenitorcell,MAPC)(Yuehuaetal.2002，Yukarietal.2003)。研究表明，MAPC具有胚胎干细胞的某些特征，不仅可在体内、外分化成包括3个胚层来源的几乎所有组织的细胞，而且具有极强的增殖能力,体外培养扩增后至少可传30代以上。
其表面标志为：CD13⁺、CD44^-、CD45
^-、c-kit^-Flk-1^dim和MHC-IIclass^-。

1.材料与试剂

⑴MACS磁珠分选系统。

⑵扩增培养基组成：60%DMEM-LG;40%MCDB-201;Ix胰岛素-转铁蛋白-砸；Ix油酸-牛血清白蛋白；10^-8m0I/L地塞米松；10^-4moI/L抗坏血酸2-磷酸盐；lOng/mlPDGF-BB;I0ng/mlEGF;2%胎牛血清。

2.方法

(1)取健康人骨髓，用l.〇77g/ml的Ficoll-Hypaqiie分离液分离获得单个核细胞。

⑵以IxlO⁵个/cm2的密度接种于纤维结合素包被的培养皿底部，加入上述扩增培养基。

(3)24h后，去除未贴壁细胞。

⑷细胞长到80%融合后，以5xIO³个/cm2的密度进行扩增培养。

(5)继续培养2〜3周。

(6)收获细胞，利用MACS磁珠分选去除CD45⁺/GlyA⁺阳性细胞。

(7)然后将洗脱的细胞以10个/孔的密度接种于纤维结合素包被的96孔板中培养，细胞密度维持在(0.5〜1.5)xl0³个/
cm2。

3.结果检测

人骨髓来源的MAPC形态呈多角形(图4.9)，细胞胞质少，胞核周围有颗粒其倍增时间为48——60h。

4.注意事项

(1)MAPC培养与培养条件、细胞密度、CO2浓度、培养基pH、胎牛血清及培养皿的类型等均有关。

(2)由于高密度下MAPC易分化，因此不同种属来源的MAPC的细胞种植密度不同：小鼠和大鼠MAPC最适密度为500——1000个/cm²,人MAPC最适密度为1500〜3000个/cm²。