实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1.从［+］和［-］的细胞或组织获得cDNA文库。

本方案假设［＋］和［-］文库是λ噬菌体文库。如果这两种文库的载体都是质粒的话，那么它们都只需要100ug。插入片段需琼脂糖凝胶电泳纯化，而不仅仅是蔗糖梯度离心纯化。

2.使用大规模的DNA纯化柱从［＋］和［-］文库中各纯化＞1mg的DNA。以1mg/ml的浓度重悬于TE缓冲液中。

3.在1.5ml的微量离心管中分别消化两个文库的DNA各1mg，反应如下（终体积1.167ml）：

1ml文库DNA（1mg）

0.117ml10×EcoRI缓冲液

0.05mlEcoRI（1000U）

混匀，37℃温育5h。加入40ul0.5mol/L，pH8.0的EDTA，65℃温育10min以停止反应。进行消化的时间里，在38mlSW-28管子里准备4个10％～40％的蔗糖梯度溶液。两个管子标记为［＋］，两个管子标记为［-］。

插入cDNA片段中内在的EcoRI位点也会被切开。如果存在这种情况的话，通过这一步获得的部分长度的cDNA克隆可以被用来制作从起始［＋］文库中筛选全长克隆的探针。现在有更新的克隆位点含有如NotI位点的载体（如λZAP），这类载体的出现几乎可以完全克服上述困难。

4.每个消化产物中加入等体积的10％蔗糖溶液混匀。将［＋］文库的混匀的消化产物分成两等份，小心地加到两管标有［＋］的10％～40％蔗糖梯度溶液上。同样，将［-］文库的DNA消化物也加到标有［-］的蔗糖梯度溶液上。蔗糖梯度在20℃下，122000g（26000r/min，SW-28转子）离心过夜（18～24h）。

5.用吸头小心移除管底的0.2ml组分，其余每个组分分别放入标记好的微量离心管中，保存于4℃。

6.每隔一个组分取20ul，在用TBE缓冲液配制的1.5％的琼脂糖凝凝胶上分析所含的插入DNA片段。

7.每管中加入0.3mlTE缓冲液和1ml95％的乙醇，混匀，置于-20℃2h或置于干冰上15min，沉淀插入的DNA片段。组分中已含有沉淀DNA所需的足够的NaCl。为了能够沉淀出DNA，蔗糖梯度组分中的蔗糖必须要稀释。对于低密度组分，常常需要1～3倍的稀释。在高密度的组分中要高效回收DNA，需要更高比例的稀释。

8.将沉淀溶液解冻后，用微量离心管高速离心15min收集DNA。吸出并保存上清，一直保留到回收DNA被检查确认后方可丢弃。每管加入0.5ml70％的乙醇，再次离心，吸出上清，风干沉淀。

9.重悬、合并来自［＋］文库的插入DNA于TE缓冲液中，终浓度为0.2mg/ml。-20℃保存。

10.重悬、合并来自［-］文库来的插入DNA于100TE缓冲液中，置于冰上。各单独保存一小份400ng的［＋］和［-］cDNA，用作最终文库的评估。从1mg总的文库DNA中，预期可以回收到大于10～15的插入DNA。小份的［＋］和［-］DNA也可以用放射性标记，用作［＋］文库的差异筛选探针。

11.按如下次序混合反应体系（终体积112ul），去除［-］DNA的EcoRI末端。

100ul［-］插入DNA（10～15ug）

11ul10×S1核酸酶缓冲液

1ul1：500S1核酸酶（2U）

涡旋混匀，离心甩至管底，37℃温育30min。

12.加入下述试剂以终止反应：

5ul0.5mol/LEDTA，pH8.0

200ulTE缓冲液

300ul苯酚/氯仿/异丙醇

涡旋混匀，离心1min分相，转移上层水相到一个新的离心管里。加入30ul3mol/L，pH5.2的乙酸钠，700ul乙醇。冷冻，然后按步骤7、8离心收集DNA。沉淀重悬于100ulTE缓冲液中。

13.用AluI和RsaI将S1核酸酶处理过的［-］插入DNA消化成小片段。按如下次序混合反应体系（终体积121ul）：

100ul［-］插入DNA（10～15ug）

12ul10×AluI缓冲液

5ulAluI（50U）

4ulRsaI（60U）

涡旋混匀，离心甩至管底，37℃温育3h。加入5ml0.5mol/L，pH8.0的EDTA，65℃温育10min以停止反应。取出5ml消化产物电泳检验。

14.加入200ulTE缓冲液和300ul苯酚/氯仿/异丙醇；按步骤12抽提，乙醇沉淀。以1ug/pl的浓度重悬于TE缓冲液中。

15.用2％的琼脂糖凝胶（TBE缓冲液中）电泳检査步骤13中的5ul消化产物，EB染色。［-］DNA的消化片段应当处于50～200bp之间。

16.用［-］DNA片段杂交［＋］插入DNA。在一个0.4ml的微量离心管中加入如下反应体系（终体积51ul）

25ul去离子甲酰胺（50％的最终体积比）

10ul［-］DNA片段（10ug）

1ul［+］插入DNA（0.2，ug）

12.5ul20×SSC（终浓度为5×）

0.05ul1mol/LNaPO₄，pH7.0（10mmol/L终浓度）

0.5ul0.1mol/L，EDTA，pH8.0（1mmol/L终浓度）

0.5ul10％SDS（0.1％终浓度）

1.0ul10mg/ml酵母tRNA（0.2mg/ml终浓度）

涡旋混勻，离心甩至管底，沸水浴变性5min。再次轻甩离心管，37℃温育18～24h。

17.加入200ulTE缓冲液，将混合物转移到一个1.5ml的微量离心管中。用250ulTE缓冲液洗涤杂交管后加入杂交混合物（现在的体积是500ul）加入500ul苯酚/氯仿/异丙醇，涡旋混匀，离心1min分相。

18.转移上清水相到一个新的离心管里。按上一步用500ul苯酚/氯仿/异丙醇再抽提一次。加入50ul3mol/L，pH5.2的乙酸钠，1ml乙醇，按步骤7、8沉淀。沉淀重悬于12ulTE缓冲液。

19.连接插入DNA和λgt10（不是λgt11）噬菌体臂。混合如下反应体系（终体积25ul）：

12ul插入DNA

10ulλgt10磷酸化的臂（10ug）

2.5ul10×连接缓冲液

0.5ulT4DNA连接酶（200U）

用吸头上下轻轻吹吸混匀，12～15℃温育过夜。

20.准备一份新鲜的E.coliC600hflA的过夜培养液。第二天上午，按照厂家说明，用8～10个商品化的λ噬菌体包装抽提物包装步骤19的连接产物。

这里使用λgt10载体是因为当生长在合适的宿主菌中时，它可以对重组子进行选择。10ugλ噬菌体载体在摩尔数上大约相当于所加入的［＋］DNA的EcoRI末端的摩尔数。必须考虑［＋］DNA的EcoRI末端，即使在变性杂交后只有少部分［＋］插入DNA片段能被克隆。推荐的10ug载体和不少于8～10个包装抽提物能确保很好的文库多样性。

21.包装混合物中加入悬浮介质，一起倒入一个5ml的聚丙烯管里，调整终体积到2ml。加入2滴氯仿，用手摇晃3s，使氯仿沉淀。

22.按照文库的扩增方案，取0.2ml和3ml新鲜的C600hfA菌液混合，接种于150mm的平板上，总共10块。放置于37℃培养过夜。

23.第二天上午，取一块平板计数噬斑，所得个数乘以10得到文库中总得重组子。

24.用悬浮介质洗脱板上的噬菌体或直接跳出单个噬斑筛选。

25.评估新建的差减文库。

最好的办法是扩增文库，差异筛选两块从单个长有20000～40000个重组子的150mm平板上来的尼龙膜。一块和总的［＋］cDNA探针杂交，另一块和总的［-］cDNA探针杂交。总的［＋］和［-］cDNA探针是放射性标记的第10步中保存的［＋］和［-］cDNA。大多数克隆应当能和［＋］探针杂交，而几乎没有能和［-］探针杂交。用一种蛋白探针如actin或tubulin进行杂交是不合适的，根据多种因素推测，结果是没有杂交发生（或只有很少）。