1.制备感受态细胞

1.1将大肠杆菌HB101在LB琼脂平板上划线，37℃培养16～20h。

1.2在划线平板上挑一个单菌落于盛有20mlLB培养基的250ml三角瓶中，37℃振荡培养到细胞的OD₆₀₀值为0.3～0.5之间，使细胞处于对数生长期或对数生长前期。

1.3将培养物于冰溶中放置10min，然后转移到2个10ml预冷的无菌离心管中，4000r/min，0℃～4℃亡离心10min。

1.4弃上清，倒置离心管1min，流尽剩余液体后，置冰溶10min。

1.5分别向二管加入5ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液悬浮细胞，置冰浴中20min。CaCl₂的纯度至关重要，不同厂家，甚至同一厂家不同批号的产品，均影响感受态的形成。

1.64000r/min，0℃～4℃离心10min回收菌体，弃上清。分别向二管各加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl₂溶液，重新悬浮细胞，

1.7按每份200ul分装细胞于无菌小塑料离心管中，如果不马上用可加入终浓度为10％的无菌甘油，置-20℃或-70℃存备用。

制得的感受态细胞，如果在4℃放置12～24h，其转化率可增高4～6倍，但24h后，转化率将下降。

以上均严格无菌操作。

2.转化

2.1加10ul含约0.5ug自制的pUC18质粒DNA到上述制备的200ul感受态细胞中。同时设三组对照：不加质粒；不加受体；加已知具有转化活性的质粒DNA。具体操作参照下表进行。

2.2将每组样品轻轻混匀后，冰浴30～40min，然后置42℃水浴热激3min，迅速放回冰浴1～2min。

2.3向每组样品中加入等体积的2×LB培养基，置37℃保温1～1.5h，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。

2.4每组各取100ul混合物涂布于含氨苄青霉素（50ug/ml）的选择平板上，室温下放置20～30min。

2.5待菌液被琼脂吸收后，倒置平板于37℃培养12～16h，观察结果。