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大鼠主动脉内皮细胞培养实验一贴块法
蚂蚁淘
/发布时间:1628271002 /浏览量:149
| 实验方法原理 | 贴块法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养，其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞，前者的贴壁时间和内皮接近，后者贴壁较内皮慢，而且会被肝素所抑制。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 雄性Wistar大鼠 试剂、试剂盒 | DMEM胎牛血清内皮细胞生长因子肝素钠青链霉素明胶胰蛋白酶PBSD-Hanks’液 仪器、耗材 | 手术器械眼科剪眼科镊培养皿手术刀培养瓶CO2培养箱
实验步骤 | 一、实验方法 1.颈椎脱臼处死大鼠，将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1 min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放含无菌D-Hanks’液培养皿中。 2.用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后，用含抗生素的D-Hanks’液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。 3.用眼科剪纵向剪开血管，平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1mm3 大小的动脉植块(或者用剪刀剪，依照个人习惯)，然后种植到培养瓶或培养皿(培养瓶或皿用1%明胶预置37℃下过夜，使用前2 h移入CO2培养箱中。用时可以先经含10%小牛血清的培养液冲洗)。将动脉植块的内膜面与瓶底接触，种植密度约为1块/cm2 。 4.置培养箱中静置2h(干贴壁)。然后，加入0.5ml含25%胎牛血清的培养液，液量以略盖过动脉植块内膜面，而又不使植块漂浮为宜。24h后，更换培养液，加入2-3ml培养液。 其他 | 一、实验讨论 植块培养法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养，其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞，前者的贴壁时间和内皮接近，后者贴壁较内皮慢，而且会被肝素所抑制。 而由于成纤维细胞生长较快，随着传代次数越多，其污染的程度越重，从而使培养失败。因而，抑制和减少成纤维细胞是大鼠主动脉内皮细胞培养的关键问题。本法采用的方法是： 1.在合适的时间去除动脉块，即当内皮细胞已经爬出，初具规模时(大概在72h左右的时候，按照本文的培养液条件，因为有生长因子，内皮容易爬出和增殖)，去除动脉块，并刮除成纤维细胞。 2.使用含肝素的培养液(在培养液中加入100U/ml的肝素)，可使内皮细胞纯度提高； 3.高浓度的血清和50µg/mlECGF可以充分地促进内皮细胞增殖，而使内皮细胞成为优势细胞。另外，动脉植块干贴壁的时间不宜超过2h，而加培养液这一步骤尤为关键，过少会使内膜接触不到培养液，过多则易使动脉小块漂浮，导致贴壁失败。因此，干贴壁后加培养液，加入少量高营养的培养液(0.5-1ml)，可以避免这些问题。 组织块贴块的时候，不可避免会有一些块贴的方向不是内膜面，那么最后将爬不出内皮，甚至长出较多杂质细胞，需刮除。 另外，部分块即使大小合适，方向也正确，也可能爬不出来，去除组织块的时候，应该以大局为重，看到内皮细胞已经爬出较多，而杂质细胞也开始爬出的时候，就要果断地去除组织块了。72h只是个大概的时间，初学者不可以拘泥。
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