蛋白质A和蛋白质G
依我们的经验，蛋白质A和蛋白质G为从血清、腹水、细胞培养上清中纯化单克隆抗体提供了最好的方法。纯化后的终产品纯度最低可达95%，可用于各种实验和操作。用蛋白质A或蛋白质G进一步处理纯化的单克隆抗体所得到的抗体，可用来进行临床前期或临床试验。现在也有许多纯化仪器使这些操作自动化。

一、蛋白质A

蛋白质A是细菌细胞壁的一个构成组分，对Fc区域有高度结合亲和性，蛋白质A可以从一些供应商那里获得，可以是单纯的形式或者螯合到树脂上。有些供应商提供预装柱，但是根据个人实验进行装柱并不难。凭借结合和洗脱条件，蛋白质A能够依据亚型来纯化单克隆抗体。例如，小鼠的腹水含有自身免疫球蛋白（一般为IgGl和IgM)和杂交瘤分泌的单克隆抗体。蛋白质A在低盐条件下不结合IgM,与IgGl有微弱的结合。因此，如果单克隆抗体的亚型是IgG2a、IgG2b或者IgG3,那么便可获得相对纯净的这些单克隆抗体。在高盐（约3mol/L)结合缓冲液的条件下，蛋白质A可成功用于纯化IgGl。在这种条件下，当用腹水作为来源材料时将会有一些自身免疫球蛋白。如果必须去除这
些自身免疫球蛋白，那么应该用细胞培养进行制备单克隆抗体(第5章）。

二、试剂

10XPBS：I.5mol/LPBS,pH7.6

NaCl(固体）

结合缓冲液：3.Omol/L的NaCl，100mmol/L柠檬酸/磷酸盐缓冲液中，pH9.O

洗脱缓冲液：100mm〇l/L柠檬酸/磷酸盐缓冲液，pH3.0

平衡缓冲液：1.0mol/LTris

透析缓冲液：150mmol/LPBS;pH7.6

A.操作步骤

(1)根据将要纯化的抗体数量来决定预装或购买柱的大小。蛋白质A的结合能力是每毫升树脂可结合5〜20mg的免疫球蛋白。因此，如果要纯化10〜IOOmg的蛋白质，那么5〜IOml的凝胶柱应该足够。当要纯化克级数量时最好用50〜IOOml的凝胶。

(2)清洗并干燥一个玻璃柱（如果是购买的蛋白质A-琼脂糖预装柱，则可忽略此步）。将结合了蛋白质A的琼脂糖浆液倒入柱内。让凝胶颗粒自然下沉，使结合缓冲液以约5ml/min的初始速度流过柱子。一定不要让柱子流干。加入3〜5个柱体积的结合缓冲液让其穿过柱子以洗去颗粒中的储存液。柱子清洗完后可立即使用或者于4°C保存。

(3)原液在上柱前都使其澄清。离心并经过玻璃纤维滤器(如WhatmanGF/C)过滤会把腹水及血清中的脂质、微凝块及其他不想要的成分除掉。

(4)在准备细胞培养上清时，培养上清的来源很重要。来自传统培养装置的培养上清，包括T型瓶、自旋瓶、滚瓶或灌注培养系统等，应浓缩10倍。而来自于一些高级培养系统的培养上清，如中空纤维及斧式搅拌生物反应器，除非体积很大，否则不需要浓缩。培养上清的浓缩是为了易于操作。在上述两种情况下，培养基在收获和浓缩后，一定要经过离心和过滤来使其清亮。

(5)腹水、血清或者培养上清被澄清后，9ml原液要加Iml10XPBS溶液。确定原液的最终体积并根据这个公式加入NaCh原液体积（ml)X0.1753=要加人的NaCl克数。加人盐并搅拌至其溶解。

(6)在加原液前,柱子要从储存处拿出使其温度平衡到室温，并用结合缓冲液冲洗。建议用紫外检测仪监测流出物，这样蛋白质从柱子中流过和流出时便可以观察和记录到。当结合缓冲液到达基线并平稳时，就可以上样了。

(7)加入柱子中的抗体上样原液量与柱的大小及每毫升原液中所含抗体的估计数量有关。大多数蛋白质A的抗体结合能力至少为4〜5mg抗体/ml凝胶。因此，如果是IOml的柱子，加入的抗体量应少于40〜50mg。通常情况下，血清中抗体的含量是5〜10mg/ml，腹水中抗体的含量为3〜12mg/ml，细胞培养上清如果被浓缩，其抗体含量将为0•2〜2mg/ml。

(8)当结合缓冲液的液面与柱床表面相平时，向柱内缓慢添加抗体上样原液。让原液充分流入柱床。当所有原液进人柱床后，再用几毫升结合缓冲液淋洗柱壁。让此液也进入柱内。然后添加结合缓冲液让原液继续流过柱床。继续添加结合缓冲液，与此同时用280nm(A28。）的吸光值来监测流出柱子的蛋白质。

(9)准备好一个干净的玻璃容器。向容器中加入lmol/LTris，其量为抗体洗脱液体积的1/10。例如，如果抗体洗脱液为10ml，那么就向容器中加人Iml的lmol/LTris溶液。

(10)当280nm(A28。）的吸光值回到基线时，加洗脱缓冲液。当吸光曲线表明蛋白质开始流出柱子时（此为纯化抗体），将装有Tris的容器放在柱子的下面来收集纯化的抗体。当记录曲线返回接近于基线并达到平稳时，对抗体的洗脱完成。一般情况下，因为洗脱缓冲液和结合缓冲液的盐浓度不同，在280nm的吸光值也有些许的不同而导致记录曲线不再返回初始基线，抗体洗脱完成后会出现一个新的基线。

(11)所有抗体收集完毕后，加结合缓冲液。用至少两个柱体积的结合缓冲液清洗柱床或者直到280nm(A28q)的吸光值记录曲线返回初始基线。

(12)这时，柱子便可用于抗体原液的重复上样（为检测样本是否过量上样，可将前的从柱中用结合液洗脱的A28q所测的第一个宽峰的废液重新上样）。抗体原液可重复上样直到全部收获。洗脱下来的抗体可保存于4°C，每次收获的抗体可加在一起直到整个纯化完成。最好检测一下所收获的抗体的pH，确保其为7.2〜7.6。

(13)从抗体原液中纯化抗体全部完成后，应采用PBS溶液对纯化的抗体进行透析。透析后抗体有可能需进行浓缩，因为透析可能导致抗体被稀释。大多数抗体的浓度可被安全的浓缩到1〜10mg/ml。单克隆抗体在浓缩的过程中有可能出现沉淀。如果担心损失抗体，可将其只浓缩到2〜5mg/ml。

(14)需要注意IgGl抗体在如此低的pH(pH3.0)条件下的洗脱。IgGl在pH6.O时即可被洗脱下来，这点在计划纯化策略时值得考虑。如果单克隆抗体在极低pH条件下不稳定，那么使用pH为4.5〜6.O的洗脱液可能对抗体的稳定性很重要。此外，还可考虑梯度pH洗脱的方法，可使柠檬酸/磷酸盐缓冲液的浓度保持不变而逐渐降低ph。这种方法可使抗体得到在最适pH时的洗脱。

(15)此方案适用于小鼠抗体的所有亚型。但是，温和一些的纯化条件可用于IgG2a、IgG2b或者IgG3亚型的纯化。用低盐结合缓冲液（缓冲液中含〇.5mol/LNaCl)替代高盐结合缓冲液(如柠檬酸/磷酸盐缓冲液中含3mol/LNaCl)，使用下面的公式计算NaCl的量来「固定」原液中的抗体于柱上：原液的体积（ml)X0.0292=要加人的NaCl克数，调节pH至9.0。这种改变将有助于降低腹水中的宿主自身IgGi被同时纯化。由于这些亚型与蛋白A结合的十分牢固，所以它们必须在PH为3.O〜4.5时被洗脱下来。在任何情况下，确保用Tris来中和洗脱下来的抗体，以阻止其变性或降解。

图7.2显示了经蛋白质A纯化的腹水和细胞培养上清中的单克隆抗体的纯度。

三、蛋白质G

蛋白质G是构成细菌细胞壁的另—种蛋白质，对免疫球蛋白的Fc区域具有高度的亲和性。依据我们的经验，蛋白质G结合人和除了兔以外的动物血清中的抗体效果最好，尽管也可用其来纯化鼠的单克隆抗体，但是蛋白质A纯化小鼠的和兔的抗体更好。

四、试剂

IOX乙酸钠缓冲液：I.〇m〇l/L乙酸钠；PH5.O

结合缓冲液：lOOmmol/L乙酸盐缓冲液，pH5.O

洗脱缓冲液：l〇〇mmol/L甘氨酸，pH2.5

平衡缓冲液：I.Omol/LTris

透析缓冲液：150mmol/LPBS，pH7.6

A.操作步骤
蛋白质G的使用与蛋白质A类似。蛋白质G被交联到树脂上，可以预装柱或者匀浆的形式购买。抗体上样原液的准备与上面提到的蛋白质A纯化需考虑的因素相同。因此，上面蛋白质A的步骤（1)〜（4)亦可应用于此且不再重申。此实验方案从抗体上样原液的准备开始。

(1)使用一些方法使抗体上样原液清亮，9ml的抗体上样原液加ImlIOX乙酸钠缓冲液，调节pH至5.0。

(2)将抗体原液加到蛋白G柱上，使其流入基质。然后立即添加结合缓冲液保持液体流。当所有的未结合物被洗出柱床，监测器返回基线时，加入洗脱缓冲液。

(3)将洗脱的抗体收集到一个含lmol/LTris缓冲液的烧杯中。收获的抗体将会被Tris缓冲液稀释10倍。

(4)与之前所介绍的蛋白质A纯化相同，柱子可重复上样直到全部抗体原液被纯化。将收获的洗脱抗体在PBS溶液中进行透析。
图7.3显示的是蛋白质G纯化多克隆抗血清的结果。图7.3中可以看出，纯化的多克隆抗体是一系列电泳迁移率不同的抗体混合物。相对于单克隆抗体的独立条带，多克隆抗体表现为弥散的形式。这两条泳道代表两个批次纯化的相同多克隆抗体。

B.纯化柱的再生和复性
蛋白质A和蛋白质G凝胶柱可重复使用。但是，重复使用这两种基质需要注意的几点。最好是一个柱子用来纯化一种抗体,但是对于每个实验室来说这未必可行。如果一个柱子要用来纯化不同抗体，那么柱子应该再生。纯化柱再生的方法可从制造商处得到，但一般而言，蛋白质A可用2mol/L尿素、lmol/LLiCl或者100mmol/L甘氨酸再生。
如果适当，可用100mmol/LNaOH对柱子除热原。通常应该用至少两个柱床体积的这些溶液来洗柱子。每次再生后，要用PBS溶液洗柱子以清除这些溶液。柱子应该置4°C保存，可加或不加叠氮钠。

对于蛋白质G，用10〇mm〇l/LpH2.5的甘氨酸来再生柱子。与蛋白质A—样，柱子应置4°C保存，可加或不加叠氮钠。