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免 疫 球 蛋 白 M(IgM)和 免 疫 球 蛋 白 D(IgD) 的纯化一免 疫 球 蛋 白 M(IgM)和 免 疫 球 蛋 白 D(IgD) 的纯化
实验步骤 | 基本方案1用透析和凝胶过滤层析法纯化IgM此法纯化的IgM可达到较好纯度,可用于酶解、异硫氰酸盐荧光素(FITC)标记、生物素标记或放射性标记。 材料(带V项目见附录1)腹水或单克隆抗体(MAb)上清(单元1.4) PBS Sorvall离心机,SS-34型转子(或类似转子) 26mmX900mm层析柱,填有适当凝胶过滤(SE)树脂(CPI附录31) 1.单元L5离心和去除IgG中脂类物质的方法纯化腹水上清,若是MAb上清,室温或4℃,15000g离心30min,去除细胞碎片,保留上清。 2.将澄清的腹水或MAb上清转至透析袋中,在4°C下用≥10倍样品体积的蒸镏水透析24h,在室温或4°C下将透析好的溶液以15000〜20OOOg离心lh,弃去上清。 3.将填有SE树脂的26mmX900mm层析柱用PBS平衡(CPI附录31),用≤5mlPBS溶解步骤2中的沉淀并上样,用PBS洗脱蛋白质并收集100个组分(1%柱体积)。 4.测A280。值确定IgM浓度(表1.5.1)。将含有纯IgM的洗脱液合并(第一个洗脱峰)。用10%SDS还原聚丙烯酰胺凝胶鉴定IgM纯度(单元12.3)。视使用的凝胶装置而定上样量,为1〜80ul。电泳上IgM显示二条带,在78kDa处的重链带和25kDa处的轻链带。 5.溶于PBS中浓度为1〜20mg/ml的IgM可于4°C或一70°C(不能冻融)保存数月,若IgM出现沉淀,可用更髙离子浓度的缓冲液再溶解(如加入NaCl)。 |
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