材料

缓冲液和溶液

贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录1。
贮存液稀释至适当浓度。

二硫苏糖醇（1mol/L)

谷胱甘肽洗脱缓冲液
10mmol/L还原型谷胱甘肽
50mmol/LTris-Cl(pH8.0)

磷酸缓冲钠盐溶液（PBS)(4°C)

TritonX-100(0.2%V/V)

酶和缓冲液

DNase(5mg/ml)

溶菌酶

RNase(5mg/ml)

凝血酶、肠激酶或Xa因子溶液
溶液的配制和贮存参照生产商手册。

凝胶

SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录8。

离心机和转头

SorvallSS-34转头或相当的转头

特别配备

谷胱甘肽-琼脂糖树脂
必要时用20%乙醇将树脂调成50%匀浆。

皮下注射针头（18#22#和25#)

载体和细菌菌株

表达GST融合蛋白的大肠杆菌细胞（方案1或2的步骤17所制备的细胞沉淀）。

方法

谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理

1.轻轻顛倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。

2.取部分匀浆放入15ml聚丙烯管（每100ml细菌培养物需要2ml匀浆)。

3.4°C500g(2100r/minSorvallSS-34转头）离心5min,小心去掉上清。

4.在树脂中加入10倍柱床体积的冷的PBS,顛倒数次，混合均匀，4°C500g(2100r/minSorvallSS-34转头）离心5min,小心去掉上清。

5.每毫升树脂加入lml冷的PBS,制成50%匀浆，顛倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。

制备细胞抽提物

6.每100ml培养物的细胞沉淀（方案1步骤17)悬于4mlPBS。

7.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,冰上放置30min。
有些方案中在亲和纯化GST融合蛋白之前，采用超声或弗氏压碎的方法裂解细胞。使用溶菌酶的方法重复性更好，而且不会引起细胞的灾难性裂解.后者释放外膜蛋白和能引起GST融合蛋白聚集或者能与其共纯化的其他分子。

8.用针筒将10ml0.2%TritonX-100强行注入黏的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。
加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4°C振动溫育10min。3000g(5000r/minSorvallSS-34转头）离心30min,去除不溶性细胞碎片。上清（细胞裂解物）转移到一只新管中，加入DTT至终浓度lmmol/L。
为防止纯化过程中树脂被堵寒，上清液需要用0.45um滤膜过滤。
加人TritonX-100的目的是防止蛋白聚集。能溶解融合蛋白又不干扰谷胱甘肽-琼脂糖亲和纯化的变性剂有1%(V/V）TritonX-lOO,含10mmol/LDTT的1%(WV)Tween-20,0.03%(m/V)SDS和1.5%(m/V)十二烧基肌氨酸（SmithandJohnson1988;Frankeletal.1991;Griecoetal,1992)。加入Tween-20、SDS和N-十二烷基肌氨酸可以替代TritonX-100或与其共同作用。请参考疑难解析：不溶性蛋白。

纯化融合蛋白

9.细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100ml细菌培养物加2ml树脂，于室温轻摇30min。

10.混合物于4°C以500g(2100r/minSorvallSS-34转头）离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

11.沉淀中加入10倍柱床体积的PBS,顛倒离心管数次混勻，洗去未与树脂结合的蛋白。

12.4°C以500g（2100r/minSorvallSS-34转头）离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

13.重复步骤11和12两次

14.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白。

用谷胱甘肽洗脱融合蛋白

a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻揽动10min,洗脱树脂上结合的蛋白。

b.如步骤12离心，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。

c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清。
经过上述洗脱步骤后，有些蛋白可能还会有大量的仍结合在树脂上，有时可能需要进一歩洗脱.而且蛋白不同洗脱体积和时间也应有所区别。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以监测洗脱液中GST融合蛋白含量。对于GST融合蛋白，一般情况是1A₂₈₀=0.5mg/ml,测定280mn吸收可以估算融合蛋白的产量，也可以采用标准的生色法（LowryorBradford)测定融合蛋白的产量，如果采用Lowry法，样品必须先用2000倍体积的1XPBS透析，去除谷胱甘肽，否则的话会干扰测定，而Bradford法不受谷胱甘肽的影响。

蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白

a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa因子（根据融合蛋白中的位点选择)。每毫升树脂加入50单位溶于lmlPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混勻，室温下振荡2~16h。用小规模试验确定精确时间。

b.4°C以500g（2100r/minSorvallSS-34转头）离心5min,上清小心转移到新管中。
GST仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也在上清中。用传统的层析方法或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离白和蛋白酶。

15.10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步（细胞抽提、洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。