酶免疫分析

酶免疫分析，如ELISA，是免疫分析的主要部分。理解了ELISA的实验原理，就可以理解其他以抗原-抗体反应为基础的实验原理。依据其实验操作程序，我们知道EUSA方法能检测任何给定抗体的特异性、亲和性、浓度及灵敏性。下面是进行直接或间接ELISA的操作步骤。直接与间接ELISA的操作步骤基本是相同的。不同之处是与目标配体相结合的一抗是否是酶标抗体。在直接分析中，一抗是酶标抗体；在间接分析中，一抗不是酶标抗体，酶标记在识别一抗的二抗上。

一、试剂和材料

稀释液：150mmol/LPBS，pH7.6

包被缓冲液：200mmol/L碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.5

洗漆缓冲液：150mmol/LPBS加0.05%Tween

封闭缓冲液：150mmol/LPBS加1%脱脂奶粉

一抗，交联或不交联酶，如HRP、碱性磷酸酶或者生物素

二抗，与一种酶，如HRP、碱性磷酸酶交联或者与生物素相交联

TMB(酶底物）

终止液：0.6mol/LHCl

二、操作步骤

(1)在进行分析前，应首先建立酶标板每孔的加样策略。永远要设立空白孔作为阴性对照。例如，如果打算对血清或者培养上清进行抗体浓度滴定，我们常常是仅在奇数孔包被抗原，而如果是进行杂交瘤的阳性筛选，除了一个或者两个孔留作空白对照外，我们将整块板包被抗原。

(2)进行分析前最好过夜包被酶标板。这样，目标配体便有足够的时间与孔结合。孔板的包被可以放置在4°C，最长时间可达2周。用包被缓冲液稀释配体至2〜5|ixg/ml。每个孔用0.Iml的稀释配体进行包被。

(3)进行分析时，从冰箱里拿出包被板。倒掉孔中的液体，用洗涤缓冲液洗整块孔板3次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(4)向所有孔中加300jul的封闭缓冲液。将孔板于室温静置至少30min，然后用洗漆缓冲液洗孔板一次。

(5)在封闭孔板的同时，用PBS稀释一抗。如果是筛选抗血清，我们通常进行5倍的倍比稀释，起始点为1:50或1:100。如要检测培养上清，进行2倍的倍比稀释可能是适当的。如果是检测杂交瘤培养上清，不要做任何的稀释。

(6)如果一抗是酶标抗体，可将其进行1:1〇〇〜1:10〇〇〇稀释。可对几个稀释度的抗体进行测定。

(7)向孔中加人100W稀释的抗体。对于系列稀释的抗体，最好每个稀释度加双份孔（一共4个孔）。37°C孵育孔板30min。

(8)孵育后，用洗涤缓冲液洗板3次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(9)如果向孔板加入的是酶标一抗，越过此步而直接进行步骤10。间接分析中，向所有的孔中加人100/zl稀释的酶标二抗。30°C孵育孔板30min。
(10)用洗涤缓冲液洗孔板5次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(11)向所有的孔中加入100/xl的TMB底物。观察颜色的变化。让颜色反应到阴性对照显示轻微的颜色。这种现象未必会发生。如果不发生，5〜IOmin后终止反应。

(12)用50//1的终止液终止反应。

(13)在酶标仪上以适当的吸光波长读取孔板颜色强度的数值。TMB底物自身的背景读数为450nm〇l/L。数值越大，抗体越多。

图7.9显示的是一个滴定结果读数的直方图。一个纯化的单克隆抗体被稀释后加人
到用其特异性配体包被的板中。图7.9中可以看出，即使在单克隆抗体被稀释到6.25ng/ml时，其特异的活性仍能被检测到。