1.PK－120的纯化

1.1聚乙二醇组分制备

枸橼酸磷酸右旋糖杭凝人血浆500ml，使其含有1mol/LPMSF（蛋白酶抑制剂），0.1mg/mlpolybrene，100mmol/L赖氨酸，8mmol/LBaCl₂，然后加入25g聚乙二醇4000（PEG），搅拌30min，6000r/min离心10min，离心沉淀溶于200ml含1mmol/PMSF，0.01mg/mlSBTl（大豆来源的胰蛋酶抑制剂），2ug/mlFUT－175，10mmol/L赖氨酸，20mmol/LTris－HCl缓冲液（pH7.4），以15％PEG再沉淀。6000r/min离心10min，以相同缓冲液300ml溶解沉淀，置4℃备用。以下柱层析操作中的缓冲液都含有上述蛋白酶抑制剂。

1.2Q-Sepharose柱层析

柱体积为4cm×27cm，预先用含10mmol/L赖氨酸20mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）平衡，将上述制备的血浆PEG组分上样，流速为190ml/h。先用500ml平衡缓冲液洗脱，洗去未吸附的杂蛋白，然后用含0.05～0.2mol/LNaCl的缓冲液（总体积为1000ml），线性洗脱，收集的各组分和PK（血浆激肽释放酶）在37℃下，温孵30min，进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，被PK水解的120kDa蛋白为PK-120，制备抗体后，用双向免疫扩散法或免疫印迹法进行检测，从而鉴定含有PK-120的蛋白组分

1.3S-Sepharose柱层析

将上述得到的PK－120组分中加入PEG，终浓度达20％，用1mol/LHCl调pH至7.0，离心回收沉淀，用含10mmol/LEACA（氨基己酸、50mmol/L醋酸钠缓冲液（pH6.0）溶解沉淀，预先用相同缓冲液平衡S-Sepharose柱（2.5cm×13.5cm），上样。充分冼脱，除去杂蛋白，用含0.025～0.03mol/LNaCl的缓冲液线性洗脱，流速170ml/h，PK－120的鉴定方法同上。

1.4HTP（羟基磷灰石）柱层析

用10mmol/L磷酸缓冲液（pH7.4）平衡HTP柱（1.8cm×10cm）。PK-120组分上样，用20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.4）洗脱，流速120ml/h。

1.5SepharylS-200凝胶过滤柱层析

上一步骤得到的PK-120组分，用Centriflomembrane（25kDacutoff；Amicon）浓缩，以含0.1mol/LNaCl，0.1％NaN₃，50mmol/LTris-HCl缓冲液（pH7.4）平衡SepharylS-200柱（2.4cm×63cm）。上样，洗脱，流速20ml/h。由此得到的PK-120作为纯化样品供以下实验用。

2.分离纯化肽段及测定氨基酸序列

纯化的PK-120温孵，37℃30min（酶与底物的比例为1:50）。用0.1mol/LNaCl，Tris-HCl缓冲液（pH7.4）平衡SepharylS-200柱（2.4cm×63cm）。上样。由PK水解PK-120产生的70kDa和35kDa分别来自PK-120的N末端和35kDa片段经赖氨酸内切酶水解测定的多肽序列C末端。由C末端来源的35kDa经吡啶乙基化（S-pyridyethylation）还原反应，再用赖氨酸内切酶水解，37℃，16h（酶与底物的比例1:50）。上样反相高压液相BondasphereS-5C8300A柱，流动相为水-乙腈-0.1％TFA，收集各组分，进一步上样方向高压液相TSK-GELODS-120T柱进行层析分离，收集洗脱各肽段，用AppliedBiosystemsmodel477A气相蛋白质自动测序仪/AppliedBiosystems120APTH分析仪以Edman降解法对分离肽段N末端进行氨基酸序列分析，结果如图所示。