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重组蛋白纯化的基本策略
及的具体步骤最终取决于样品的性质。但也有共同可参考的阶段 捕获阶段:目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段:目标是除去大多数大量杂质,如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段:除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。 分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法: 蛋白质的性质 方法 电荷(等电点) 离子交换(IEX) 分子量 凝胶过滤(GF) 疏水性 疏水(HIC)反相(RPC) 特异性结合 亲和(AC) 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率:由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说,当杂质和目标蛋白性质相似时,在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量:一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度:在初纯化中是重要因素,此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率:随着纯化的进行渐趋重要,因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表: 技术 主要特点 捕获 中度纯化 精制 样品起始状态 样品最终状态 IEX 高分辨率 高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★★ 低离子强度 样品体积不限 高离子强度或pH改变。 样品浓缩 HIC 分辨率好 容量好 高速度 ★★ ★★★ ★ 高离子强度 样品体积不限 低离子强度 样品浓缩 AC 高分辨率 高容量 高速度 ★★★ ★★★ ★★ 结合条件特殊 样品体积不限 洗脱条件特殊 样品浓缩 GF 高分辨率 (使用Supedex) ★ ★★★ 样品体积(<总柱体积的5%)和流速范围有限制 样品稀释 RPC 高分辨率 ★ ★★★ 需要有机溶剂 在有机溶剂中,有损失生物活性的风险 提示: 1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少,以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。 2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法,所以HIC是捕获阶段的理想方法。 3、GF很适宜在由浓缩效应的方法(IEX、HIC、AC)后使用,凝胶过滤对上样体积有限制,但不受缓冲液条件的影响。 4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或/和处理量的方法 5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下,可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。 6、只要目标蛋白耐受的情况下,可以考虑采用RPC方法用于精制阶段。 注:应该指出,三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 附:纯化工艺路线
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