高效色谱法

如文献所述，采用基于非重力的色谱技术，如HPLC，仅用一个小容积的柱子也可以纯化出纯度极高的抗体[3]。尽管未在本实验室操作，这种技术在下列情况下特别有用：分离和鉴定小量蛋白质样本（如活检组织）时，亲和结合能力必须被测定并用于治疗用途时；当需要大量筛选样本（如筛选抗体）时；或者需去除抗体中内毒素污染时[4]。

Josic等使用Affi-GelBlue柱对兔抗转铁蛋白抗血清进行了HPLC纯化[3]。用小鼠腹水也得到类似的结果。在纯化的第一轮，用反向NaCl梯度法，白蛋白在0.4mol/LNaCl时被洗脱下来JgG要在低得多的NaCl浓度下才被洗脱下来，根据Josic等的结果，这种处理大大增加了随后的HPLC柱分离能力。

Bowles等发明了用高效轻憐灰石色谱法（highperformancehydroxylapatitechromatography,HPHT)或者DEAE5PW(WatersProteinPak公司）高效液相色谱法（HPLC)大规模纯化完整IgG单克隆抗体的方法[5]。对于用HPHT从澄清腹水中纯化抗体，Bowles等将腹水进行透析、稀释并经0.22JLOI1Millip0re滤膜过滤，然后上样到B10Rad公司的MAPS(单克隆抗体纯化系统）柱上，然后用20〜300mmol/L梯度磷酸盐缓冲液(pH6.8)进行洗脱，IgGl在大约250mmol/L的浓度下被洗脱下来。IgG峰（约IOOmg)为洗脱蛋白质总量的25%〜30%。不过，一些抗体似乎显著减少柱的使用寿命，有可能因为在稀释步骤抗体形成了凝集[6]。经HPHT方法收集的IgG经过木瓜蛋白酶消化后产生Fab片段，再用MAPS(单克隆抗体纯化系统）HPHT柱上纯化并用线性磷酸盐梯度进行洗脱，Fab片段在120〜150mmol/L磷酸盐时被洗脱下来。Bowles等也用DEAE5PWHPLC纯化出抗体并将纯化的抗体进行SDS-PAGE分析，发现这种方法纯化的抗体有少量的污染蛋白[5]。
Manzke等介绍了一种抗体大规模生产并用疏水作用HPLC方法进行单步纯化双特异性单克隆抗体的方法，这种方法每月可得到8〜12g的IgG产量。双特异性抗体主要被用于临床治疗，如治疗人类肿瘤，也可能用于抗病毒感染W。

Manzke等使用的抗体来自于杂交-杂交瘤（tetradoma)，这种抗体的轻链和重链分别来自于母代的两种杂交瘤细
胞(具有识别两种抗原的能力，译者注）[7]。用中空纤维生物反应器对此tetradoma被进行扩增培养，收获培养上清并过滤（0.2^m)，调至I.Omol/LAS和100mmol/L磷酸盐缓
冲液（pH7.9)，再过滤，并上样于一个8ml的Phenhyi-SuperoseHR10/10柱（Pharmacia)。用AS梯度递减（l.Omol/L〜Omol/L的AS和磷酸盐缓冲液)洗脱抗体。此柱有效地将双特异性抗体(IgGl/IgG2a)与来自母代杂交瘤细胞的单一独特型抗体分开，双特异性抗体在40〜25mmol/LAS时被洗脱。