================  蚂蚁淘在线  ================

免责声明：本文仅代表作者个人观点，与本网无关。其创作性以及文中陈述文字和内容未经本站证实，对本文以及其中全部或者部分内容、文字的真实性、完整性、及时性本站不做任何保证或承诺，请读者仅作参考，并请自行核实相关内容

版权声明：未经蚂蚁淘在线授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经经本网授权使用作品的，应该授权范围内使用，并注明“来源：蚂蚁淘在线”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。

• 

  资质认证

  获得国家资质，权威认证！

• 

  全国联保

  全国联保，官方无忧售后

• 

  正规发票

  正规发票，放心购买

• 

  签订合同

  签订合同，保障您的权益

购物指南

购物流程

注册登录

账户管理

订单查看

常见问题

FAQS

蚁豆兑换

物流说明

评论规则

发票说明

价格说明

支付说明

服务协议

版权声明

诚信保障

免责申明

销售协议

隐私条款

法律申明

售后服务

退换货政策

工作时间

退款说明

售后支持

售后申请表模板列表

关于我们

公司简介

联系我们

资质证书

人才招聘

商务合作

万众创业

网址导航

蚂蚁淘商城

科研狗

苏州蚂蚁淘

生物信息网

现货促销

微信公众号

copyright©2005-2021 蚂蚁淘在线版权所有　苏州蚂蚁淘生物科技有限公司 www.assay-online.com ICP号：苏ICP备17049038号-16

/**/

实验材料	韧皮部汁液
试剂、试剂盒	HClNaOH丙酮甲醇DTTβ-苯巯基乙醇
仪器、耗材	刀片螺旋盖试管
实验步骤	3.1收集木质部汁液 木质部汁液属于植物细胞外空间，含有的特殊蛋白质的种类和浓度随植物的状态而变化。因为纯净的木质部汁液容易从大多数植物中得到，所以容易用蛋白质组学工具进行木质部汁液蛋白质的鉴别。准备进行单向电泳（1-DE)或双向电泳（2-DE)分离的蛋白质样品时，要考虑到蛋白浓度很低，且含有低聚糖（及糖基化蛋白）。用1-DE或2-DE进行木质部汁液蛋白质样品分析，有两个基本步骤，即收集木质部汁液和浓缩蛋白质。 (1)用刀片切割植物的茎，收集从根侧茎中自然流出的汁液（由于根压流出）（图4-1)。植物的茎可以在任何髙度被切割，不过通常来讲，切割部位离茎基部越近，流出的汁液量越大。但是莲的切口要达到一定高度（大约10cm)以便连接一个放在冰中的管子（见注释1)。 (2)汁液收集。 a.将剩下的茎段水平放置，把一根管子接在切口处。管子放在一个装有冰块的容器中，然后收集汁液达6h (图4-1C；在汁液收集的过程中，容器冰块需补充；见注释2)。 b.另一种方法是，渗出的木质部汁液可以每隔几分钟用移液管重复收集，液体收集到放置在冰块上的反应管里。 (3)收集汁液前要清洗切口，以除去被切细胞的细胞质和切割韧皮部时直接流出的汁液（见注释3)。 (4)在浓缩蛋白质前，可以用离心的方法除去颗粒状物质，像土壤颗粒、微生物细胞或残留的组织。 3.2浓缩木质部汁液蛋白 木质部汁液不但含有蛋白质，也包含碳水化合物（见注释4)和其他化合物，如氨基酸、盐及多酚（在被病原体侵染的植株中)。 如果进行1-DE，简单的蛋白质沉淀就可以，甚至可以用乙醇（4份95%乙醇/5%0.1mol/LNaAc加入1份蛋白质样品中），尽管乙醇也可以沉淀多聚和低聚糖。 如果进行等电聚焦，汁液应该用Amicon过滤装置进行部分提纯和浓缩，之后用TCA/丙酮进行沉淀。 1.用Amicon过滤装置进行蛋白质的部分提纯和浓缩 用AmiconCentriprepYM-3离心超滤浓缩器（最多15ml，自动开关：3kDa)和(或）AmiconCentricon Plus-20离心超滤管（更大的容积，自动开关：10kDa)过滤装置，对木质部汁液进行浓缩及部分提纯。 (1)离心后除去微粒状物质，将最多15ml (AmiconCentriprepYM-3)或者19ml(AmiconCentricon Plus-20)木质部汁液加入样品容器中。 (2)在4°C、3000g旋转AmiconCentriprep YM-375min直到达到平衡（过滤收集器里外液面之间）。 (3)在4°C旋转AmiconCentricon Plus-20，4000g，15min。轻轻倒出滤液，再加入19ml木质部汁液到样品过滤杯中。 (4)再旋转15min。 (5)轻轻倒出滤液，如果需要进一步浓缩，则重复旋转和倒出滤液的步骤。 (6)直接从Centriprep YM-3中收集浓缩液（至少500μl)。 (7)在1000g旋转倒置部分（invertedunit) 5min，从Centricon Plus-20收集浓缩液（至少200μl)。 2.用TCA/丙酮沉淀蛋白质 (1)将4份100%丙酮溶液（含12.5%TCA和0.0875%β-巯基乙醇）加入1份蛋白质中，并混合。 (2)在-20°C反应45min以上（或用80%丙酮在0°C反应1~4h)，然后用离心机的最快速度离心30min (不需冷冻）。 (3)弃掉上清液，并用冰冷的100%丙酮漂洗沉淀3次。 (4)除去残留液体，室温晾干沉淀。沉淀可溶于重悬缓冲液（2mol/L硫脲、7mol/L尿素、4%CHAPS、2%mmol/LDTT)[5]后用于等电聚焦，或保存在-20°C。 3.3收集韧皮部汁液 韧皮部汁液比木质部汁液更难从大部分植物体中收集。因此，韧皮部汁液蛋白组学的主要难题是收集足够多的材料。不过，可根据不同植物物种的特性应用不同的采集方法。 对于一些植物物种（如蓖麻、葫芦科植物、丝兰），切小切口或割开整个植物器官[18]可以收集韧皮部汁液。不适宜这种收集方法的植物可以通过EDTA辅助分泌法[19~21]取样。许多植物都可以用蚜口针技术[22]得到高纯度的韧皮部汁液，但是量很少。 已经被确立的模式植物，像拟南芥或是水稻，很难采集到足够量的筛管分子渗出液用于蛋白质组研究。对于拟南芥而言，可得到的样品量不足以用于蛋白质组学的研究方法[10]，对于水稻而言，只有一些高丰度的韧皮部汁液蛋白质能够通过planthopper口针渗出液[6，23]被鉴别出来。大部分目前关于鉴别韧皮部多肽的信息来自于葫芦[8]、蓖麻[10]，最近又从油菜[7]得到了相关信息。 收集这些植物的韧皮部汁液要相对容易。两种版本的渗出技术（exudation technique)描述如下所述。 1.版本1 (1)用刀片切割植物的主茎或叶柄（图4-2)。 (2)将注射针头穿刺植物体（见注释5)。 2.版本2 (1)切割后使用地上部分一侧的断莲，用滤纸吸干切口（见注释6)。 (2)用滤纸吸去最先渗出的液滴。 将随后渗出的汁液吸取收集到一个保存在冰中的反应管（见注释7)。 3.4韧皮部汁液蛋白质的提纯 (1)在1-DE或2-DE中分离韧皮部蛋白质时，必须考虑到运输液中的高浓度糖和有机物。另外，植物对切割有御伤机制，其中包括蛋白质聚合作用[24]。 (2)对于1-DE来说，韧皮部样液可以被直接加进1-DE样品缓冲液「25」，加热，并在室温下进行凝胶电泳。 (3)对于2-DE，在样液用于进行等电聚焦电泳之前，蛋白质应该通过沉淀的方法提纯。 1.去除韧皮部主要的蛋白质1(PP1)和蛋白质2(PP2) 两种主要的韧皮部蛋白质——韧皮部丝状蛋白PP1和韧皮部凝集素PP2存在于所有双子叶植物中，并在一些植物中占全部韧皮部蛋白质的50%以上（如葫芦科植物）。 在氧化条件下，两种蛋白质通过二硫键形成不溶性聚合物[26，27]，它们会在1-DE和2-DE中形成拖尾，使分辨率下降。要移除这些蛋白质，可以使用先酸化再中和的方法[28]。以下的所有步骤都在室温下完成。 （1)用2mol/LHCl标定样液到pH2.0。  (2)用2mol/LNaOH中和样液到 pH7.5。  (3)在15000g离心15min。 (4)收集上清液并去掉含有PP1和PP2的大量白色沉淀（见注释8)。 2.用丙酮/甲醇/DTT沉淀全部初皮部汁液蛋白质 要移除碳水化合物和其他干扰成分，可以用丙酮/甲醇/DTT处理使蛋白质沉淀。 (1)加入3倍体积预冷沉淀液。 (2)在-20℃沉淀一夜（见注释9)。 (3)在6800g、4°C离心5min(见注释10)并丢掉上清液。 (4)用100%预冷丙酮漂洗沉淀物两次，并在6800g4°C离心5min。 (5)除掉上清液，室温晾干沉淀5~10min(见注释11)。 (6)将沉淀在样品缓冲液中被溶解，用于1-DE和2-DE(见注释12)。