农杆菌电击感受态的制备及电击转化

表达载体

pB-2mb-FRO-1.7A

和

pB-2mb-1.7A

空载体的农杆菌（

EHA105

）电击转化

（

1

）抽提纯化

pB-2mb-FRO-1.7A

和

pB-2mb-1.7A

空载体的重组质粒

pB-2mb-FRO-1.7A

重组载体和

pB-

2mβ

-1.7A

空载体的

（

DH5α

）

菌种接种于

5mlLB

（含卡那

霉素

50mg/L

）液体培养基中，

37

℃，

200rpm

震荡培养过夜。按

V-GENE

公司的质粒提取试

剂盒提取

pB-2mb-FRO-1.7A

重组质粒。

（

2

）取

200ml

型号的电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

（

3

）农杆菌

EHA105

电击预备处理。

I.

接种于

5mlYEP

（含链霉素

Sm50mg/L

）液体培养基中，

28

℃，

200rpm

震荡培养

过夜至

OD600

值为

0.4

。

EHA105

II.

离心管中收集

1ml

菌液，

4

℃，

8000rpm

，离心

30s

。

1.5ml

III.

去残液，沉淀用

200μl

ddH2O

充分悬浮，

4

℃，

8000rpm

，离心

30s

。

IV.

重复步骤ⅲ三次。

V.

去残液，沉淀用

200mlddH2O

充分悬浮，即为电击用农杆菌

EHA105

感受态。加

入

200μl

灭菌甘油混匀后置于

-80

℃备用。

（

4

）电击

I.

分别取

10mlpB-2mb-FRO1-1.7A

和

pB-2mb-1.7A

重组质粒至

200μlEHA105

感受态

中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II.

准备好电击装置（

BioRad

），电压为

2.5V

，用手按住电击按钮，直到啪的一声电击

完毕。

III.

室温静置

2min

后加入

800mlYEP

培养液，

28

℃静置

1h

，

然后

28

℃，

200rpm

培养

2h

。

IV.

离心

30s

，

收集菌液，

沉淀用

200mlddH2O

悬浮，

用玻璃棒涂布含含卡那霉素

50mg/L

和含链霉素

Sm50mg/L

的

YEP

固体培养基平板，

28

℃培养

48h

。

8000rpm

1.

制备农杆菌电转感受态

(1)

挑取根癌农杆菌

EHA

105

单菌落，接种于

5mlLB

〔含利福平

(Rif)

50mg/L,

；链霉素

100mg/L)

液体培养基中，

28 C,220rpm

震荡培养过夜。

(2)

将

2m1

过夜培养的菌液加到

50ml

含同样抗生素的

LB

培养基中，

28 C,

220rpm

震荡

3-4

小时，至

OD560=0.5

左右。

(3)5000rpm

离心

5

分钟，去上清。

(4)

加入

40m110%

甘油悬浮菌体，冰浴

30min.

(5)4 C,5000rpm

离心

5

分钟，去上清。

(6

加入

30mL10%

甘油重悬浮菌体，

4 C,5000rpm

离心

5

分钟，

(7)

重复步骤

6

一次，去上清，加入

2ml10%

甘油悬浮，分装于

1.5ml

的离心管中

(200p1/

管

)

备用。

2

农杆菌感受态的电转化

〔

I)

取

2ul

质粒加到

200uIEHA105

感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴

30

分钟。

(2)

把质粒和感受态混合液吸入电极杯，电击转化。

(3)

马上加入

lml

新鲜的

LB

液体培养基，

28 C,150rpm

轻摇

4-6

小时。

(4)

收集菌体涂布于含有链霉素

100mg/L),

利福平

(50mg/L)

及质粒所含的抗性的

LB

固体培