CDP用于体外转染

材料

试剂

完全培养基（含抗生素和血清），针对细胞类型进行合理选择含有环糊精的聚阳离子（CDP;20mg/ml)

冻干后的固体溶于不含DNase和RNase的水中。储液为无色。

核酸（80umol/L)

DNAzyme(Eurogentec)

质粒DNA(pDNA)

小干扰RNA(siRNA)(Dharmacon，IntegratedDNATechnologies)

用细菌DH5〇t(Invitrogen)扩增pDNA,纯化使用Novagen’sUltraMobius1000试剂盒。

DNAzyme和siRNA为化学合成，经高效液相色谱（HPLC)纯化，并用凝胶电泳验证。

核酸用不含DNase和RNase的水，或者不含RNase的乙酸钾缓冲液溶解。

Opti-MEMI低血清培养基（Invitrogen)

磷酸盐缓冲液（PBS，灭菌）

胰酶

仪器

细胞培养板（6孔或24孔）

细胞培养箱（37°C,5%CO2)

方法

1.转染前一天，胰酶消化并收获指数增长期的贴壁细胞。将细胞接种到6孔或24孔板中，细胞密度24孔板中为每孔5X10⁴个细胞，6孔板中为每孔2.5X10⁵个细胞。

2•每孔加入Iml(24孔板）或5ml(6孔板）的完全培养基，在细胞培养箱中37°C，5%CO2下培养24h。

3.配制复合物溶液：将1倍体积的CDP储存液（典型的IOmI每孔）加人到等体积的核酸储存液中。

对于体外转染，核酸浓度如高于0.2mg/ml，会导致核酸不能被等体积的CDP溶液完全结合。这种情况下混合液通常为不透明或乳状，而且基因表达或基因敲除效果差。

4.在每体积复合物溶液中加入9体积的Opti-MEM(24孔板中每孔加人180ulOptiMEM)。

5.从孔中吸出完全生长培养基。用0.5mlPBS洗涤细胞。

6•每孔加人200ul(24孔板）或1000ul(6孔板）的复合物/Opti-MEM的混合液。将培养板放回培养箱中培养4h。

7.从孔中吸除复合物/Opti-MEM的混合液。加人Iml(24孔板）或5ml(6孔板）的完全培养基。

8.在适当的时间，进行基因表达或基因敲除的检测。

用CDP进行体内转染

材料

试剂

金刚焼-PEI(50mg/ml)

AI>PEG，乳糖封端（AI>PEOLac)

AI>PEG,不含配体（AI>PEG)

AI>PEG，偶联转铁蛋白（AEHPEOTf)

冻干后的固体溶于不含DNase和RNase的水中。储液为无色（AEHPEG和AI>PEOLac)或红色/橙红（AD^PEOTf)

含有环糊精的聚阳离子（CDP，20mg/ml)

冻干后的固体溶于不含DNase和RNase的水中。储液为无色。

D-葡萄糖（10%m/V，溶于水中[D10W)

将葡萄糖溶于不含DNase和RNase的水中，0.2um的微孔滤膜过滤。所有体内实验中，注射液葡萄糖溶液终浓度均为5%。

小鼠（20g)

核酸（80umol/L)

DNAzyme(Eurogentec)

质粒DNA(pDNA)

小干扰RNA(siRNA)(Dharmacon,IntegratedDNATechnologies)

用细菌DH5<x(Invitrogen)扩增pDNA,纯化使用Novagen’sUltraMobius1000试剂盒。

DNAzyme和siRNA为化学合成，经高效液相色谱（HPLC)纯化，并用凝胶电泳验证。

核酸用不含DNase和RNase的水，或者不含RNase的乙酸钾缓冲液溶解。

仪器

27号针头

Iml注射器

方法

1•将CDP、AEKPEG和AD——PEO配体在水中混合，最终AD:(3-CD的摩尔比为I:1。

2.将上述溶液（约5CVg/20g小鼠）加人到等体积的核酸溶液中。

3.加入一体积（约lOOpg^Og小鼠）无菌DwW到等体积的上述复合物溶液中。

4.用带有27号针头的ImI注射器吸取上述复合物溶液。

5.将小鼠的尾静脉预热。

6•在2〜3s内将复合物溶液注射到尾静脉中。