材料

溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。

乙腈（5%、30%和100%)
毎个Sep-PakC18柱用10ml髙效液相（HPLC)级乙腈（100%),使用前用水稀释乙腈。

碳酸氢铵（25mmol/L,pH8.0)

含5%(WV)乙腈的碳酸氢铵（25mmol/L，pH8.0)
将5ml乙腈与95ml25mmol/L碳酸氢铵混合

TE溶液（pH7.6）

核酸与寡核苷酸

放射性标记寡核苷酸

用于纯化的原料是方案2(步骤3或步骤5）的反应混含液，并已在68°C加热灭活噬菌体T4多核苷酸

专用设备

离心干燥机（SavantSpeedVac或相应仪器)

微量离心管（1.5ml)放于管架或收集器
用于收集层析柱纯化的放射性标记寡核苷酸洗脱液

Sep-Pak经典层析柱，短柱身
毎一Sep-PBk经典层析柱（可从Millipore公司的Waters部门购买）含有360mg疏水反相层析树脂（C18）。纯化是利用寡核苷酸在溶剂（水溶液）极性较大时与树脂结合，而在熔剂（如甲醇与水混合液)极性较小时脱落的原理。每一次磷酸化反应需要一个分离柱。

注射器（10ml聚丙烯注射器）

方法

1.Sep-PakCl8反相层析柱准备如下：

a.将装有10ml乙腈的聚丙烯注射器连接于Sep-PakC18经典层析柱。

b.用注射器缓慢冲洗层析柱。

c.先将注射器与层析柱分离，再将注射器的柱芯抽出注射器针简，这样可以防止空气抽入层析柱内。将注射器针筒再连于层析柱上。

d.用10ml过滤无菌水洗去有机溶剂，共2次，每次冲洗后均重复步骤c。

2.用无菌水将放射性标记的寡核苷酸稀释至1.5ml,并将全部样品用注射器推入层析柱。

3.用下列四种溶液冲洗层析柱，每次冲洗后重复步骤1c。

10ml25mmol/L碳酸氢铵（pH8.0)
10ml25mmol/L碳酸氧铵/5%乙腈
10ml5%乙腈
10ml5%乙腈

4.3份lml30%乙腈洗脱放射性标记的寡核苷酸，用1.5ml微量离心管分别收集每个组分，每次洗脱后重复步骤lc。
警惕：磷酸化反应常常使用大于100uCi的放射性标记ATP,因此这些层析组分的放射性剂量可能相当可观。应小心、谨慎处理未摻入的放射性物质、移液器吸头及微量离心管。

5.用离心干燥机干燥含寡核苷酸的溶液（SavantSpeedVac或相应仪器）。

6.将放射性标记的寡核苷酸溶于小体积（10ul)的TE(pH7.6)。