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野生型杆状病毒的纯化实验一基本方案
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| 实验材料 | 杆状病毒 |
|---|---|
| 试剂、试剂盒 | TE蛋白酶KN-十二烷基肌氨酸苯酚氯仿异戊醇乙醇乙酸钠 |
| 仪器、耗材 | 培养瓶锥形瓶转子离心机聚苯乙烯管 |
| 实验步骤 | 1. 以每1.8×107细胞的密度接种Sf9细胞于至少10个150cm2 培养瓶中。27℃温育约2h，让细胞牢固贴壁，以0.1的感染复数用野生型AcMNPV感染。当观察到多数细胞中含有包涵体时，将病毒上清（约200ml）转移至4个50ml锥形管中。 2. 4℃1000g离心10min，将病毒上清倒入4个新的管子中。重复离心以去除所有残留细胞。 3. 将病毒上清置于SW-27超离心管中，平衡后于4℃，100000g离心30min，收集病毒。倾倒出上清，将管子倒扣于Kimwipe纸巾上，尽可能倒干液体。 4. 仔细检査病毒沉淀块，如果病毒沉淀较纯（应该是不透明、发白的外观），则转至步骤10继续进行。多数情况下，病毒沉淀块由于有细胞碎片的存在而会发黄。如果是这种情况，则用下列两种方法中的一种从细胞残序物中分离出病毒。 用蔗糖梯度分离纯化病毒团块： 5a. 加入1ml0.1×TE缓冲液，反复上下吹打重悬病毒沉淀。如果沉淀难以重悬，则于4℃温育过夜。 6a. 用溶于0.1×TE缓冲液中经过滤除菌的超纯蔗糖制备两份从25%到56%蔗糖线性梯度液，置于超离心管中。 7a. 仔细将0.5ml病毒悬液铺至每一蔗糖梯度液的顶部，4℃100000g离心90min。 8a. 用巴斯德吸管将病毒带转移至SW-41超离心管中，管的上部加入0.1×TE缓冲液。 9a. 于4℃100000g离心30min，收集病毒，弃上清，倒扣离心管于Kimwipe纸巾上，尽可能倒干液体。 微量离心纯化病毒沉淀块： 5b. 加入3ml抽提缓冲液，反复上下吹打重悬病毒沉淀。如果难以重悬，则于4℃温育过夜。 6b. 分别转移1.5ml病毒悬液于两个1.5ml微量离心管中。最大速度下微量离心5min，上清转移至一个15ml聚苯乙烯离心管中。 7b. 用1ml抽提缓冲液重悬每一团块，冼涤。 8b. 在最大速度下微量离心5min，将两份上清与15ml聚丙烯管中的上清液合并。 9b. 用抽提缓冲液补足至9ml，分成4.5ml的两小份移至2个15ml聚丙烯离心管中。转至步骤11继续。 10. 用9ml抽提缓冲液重悬沉淀，分成4.5ml的两小份移至2个15ml聚丙烯离心管中。 11. 每管分别加入200μg10mg/ml蛋白酶K，50℃保温1~2h。 12. 每管各加入0.5ml10%N-十二烷基肌氨酸钠，50℃温育2h或过夜。 13. 用等体积的25：24：1的酚/氯仿/异戊醇抽提DNA两次。 14. 用一宽嘴（5~10ml）吸管将含有DNA的水相转移至另一个15ml聚丙烯管中。加10ml100%的乙醇，倒转离心管数次，轻柔混合，于-80℃放置10min。 15. 于4℃，1500g在台式离心机中离心20min，弃上清，以70%乙醇洗涤DNA沉淀，风干30~60min。加入800μl1×TE缓冲液重悬沉淀。 16. 各取400μl移至两个微量离心管中，每管中加入40μl3.0mol/l乙酸钠和2倍体积的100%乙醇重新沉淀DNA放置10min。 17. 微量离心10min。弃上清。用70%乙醇洗涤DNA沉淀并冻干，用0.3~1ml1×TE缓冲液重悬DNA。测260nm吸光值并计算产量。DNA保存于4℃。 |
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