一、材料

1.缓冲液和溶液

ATP(0.1mol/L)

Dithiothreitol(1mol/L)

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

含聚乙二醇的1X连接缓冲液（50mmol/LTris-Cl(pH7.6)，1mmol/LATP，10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，10mmol/LMgCl₂，2%PEG8000）

低熔点琼脂糖缓冲液（100mmol/LTris-Cl(pH7.6)，20mmol/LMgCl₂）

MgCl₂(20mmol/L)

聚乙二醇（8%,m/V，PEG8000溶液）

TE(pH7.6)

2.酶和缓冲液

噬菌体T4DNA连接酶

3.凝胶

低熔点（LMT)琼脂糖

4.核酸和寡核苷酸

纯化的噬菌体λDNA

5.专用设备

Tygon管

56℃水浴

二、方法

1.在10mlLMT缓冲液中通过沸水浴或微波加热溶解0.1g低熔点琼脂糖。冷却到37℃。

2.在172.5μlTE(pH7.6)中溶解10μg纯化的噬菌体λDNA,加热该溶液至56℃ 5min。

3.冷却溶液到37℃，迅速按顺序加入下述试剂：

8%PEG8000                   62.5μl

20mmol/LMgCl₂            5.0μl

0.1mol/LATP                 5.0μl

1mol/LDTT                    5.0μl

噬菌体T4DNA连接酶     0.5Weiss单位

1%LMT琼脂糖溶液        250μl

聚乙二醇起集聚剂的作用，增加连接效率。

4.混合物吸入一个稍短的Tygon管，在冰上冷却至琼脂糖完全凝结。

5.将凝胶栓移入一个无菌的一次性塑料管内，其中有3倍体积的含聚乙二醇的1x连接缓冲液。

6.凝胶栓在连接缓冲液内室温温育24h,然后转移到10倍体积20mmol/LEDTA(pH8.0）的试管内。

7.在EDTA中温育1h,再将凝胶栓转移到新鲜10倍体积20mmol/LEDTA(pH8.0)的试管内。