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变性凝胶电泳实验一基本方案
蚂蚁淘
/发布时间:1632331802 /浏览量:84
| 实验材料 | DNA 试剂、试剂盒 | 乙醇异丙醇二甲基二氯硅烷TEMED变性丙烯酰胺溶液SDS 仪器、耗材 | 电泳仪注射器巴斯德吸管干胶机
实验步骤 | 1. 制作每块凝胶时，首先要用肥皂及水小心严格地清洗两块30cm×40cm的前后玻璃平板，用去离子水冲洗后晾干，用喷射洗瓶喷10%乙酵或异丙醇使平板湿海。 2. 然后用Kimwipe纸或其他无绒纸巾将平板擦干。 3. 戴手套在通风橱工作，用浸湿了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe纸在每片平板的其中一面加一层此溶液，并小心洗擦拭整面平板。 4. 待硅化层干后，用Kimwipe纸以70%乙醇或异丙醇擦净并干燥，最后再检查平板有没有灰尘或其他物质。 5. 按厂商指南用0.2~0.4mm均厚的垫片和大的书本装订夹子组装凝胶胶模夹层，注意垫片与平板的边、底压紧对齐。 6. 制作每块凝胶时，在100ml烧杯配制60ml所需的变性丙烯酰胺凝胶溶液，在灌胶（步骤7）前，彻底混匀60μlTEMED和0.6ml10%过硫酸铵于每份丙烯酰胺溶液中。 7. 立即灌胶，用60ml注射器小心吸出丙烯酰胺溶液，避免吸入气泡，让短平板朝上，并使凝胶平板夹层与臬面成45度角，沿着平板的一边慢慢将丙烯酰胺溶液推入两片平板之间，其间可调整角度让胶液慢馒流入夹层的一边。 8. 当溶液达到短平板的顶部时，放下胶模夹层至其顶部边缘离操作台平面仍有5cm左右，其下垫一空的吸头盒或其他物件以使之保持较低的角度。 9. 将0.2~0.4mm厚的鲨鱼齿样品梳的平齐一侧插入胶液中，至短平板下约2~3mm，操作须十分小心以避免产生气泡，用一个书本装订夹将平极之间的样品梳夹紧，以避免在掩子与平板间形成凝胶固块。 10. 加一层过量的丙烯酰胺溶液至梳子，保证其被完全覆盖。用水冲洗注射器，除去过量的丙烯酰胺。 11. 除去每片胶模夹层的底部垫片或胶带，用刀片除去样品瓶周围的过量聚丙烯酰胺凝胶。 12. 用水清洗平板表面溢出的尿素和丙烯酰胺溶液，从每片胶模夹层中拨去鲨鱼齿样品梳，避免拉伤凝胶顶部。 13. 用水清洗梳子，准备好在步骤16操作时重新插回样品孔。如果用常规样品梳，小心防止撕裂聚丙烯酰胺加样孔， 14. 凝胶电泳装置的下层贮液槽加入1XTBE缓冲液，使凝胶夹层能浸泡在2~3cm的一层缓冲液中，放入凝胶夹层并用夹子固定在电泳装置上。 15. 上层贮槽倒入1×TBE缓冲液，使超过凝胶顶部约3cm，用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE清洗凝胶顶部。 16. 将清洗干净的鲨鱼齿样品梳重新播回凝胶夹层，使其齿部仅可触及凝胶，用巴斯德吸管或Beral细管以1×TBE缓冲液彻底清洗加样孔，以除去零星的聚丙烯酰胺碎片。 17. 加样前，在45V/cm凝胶的电压降下预电泳，使凝胶预热，即在1700V，70W恒功率下电泳约30min。 18. 在加样前，清洗加样孔除去浸进孔中的尿素。 19. 在甲酰胺/染料溶液中的样品，盖好盖子，在95℃加热2min，然后置于冰上，每孔加样2~3μl测序用的加样吸头可于每次加样后在下槽缓冲液中冲洗2次后继续使用。 20. 在45~70W恒功率下电泳，凝胶温度保持在约65℃。 21. 高于此温度可能会造成玻璃平板炸裂或条带弥散，而太低温度可使测序产物不完全变性、现察标志染料的迁移以确定电泳时间。 22. 将干冰加入干胶机的冷阱并预热至80℃。 23. 电泳完毕时，排出上下液槽的缓冲液，并按放射性废物处理丢弃液体。 24. 从电泳装置中取出凝胶夹层，并在冷自来水下冲洗直至两面玻璃平板表面都冷却为止，将夹层平放在纸巾上，四口玻璃平板（短平板）朝上，除去多余的液体及夹子、胶带，取出一边的垫片。 25. 两片玻璃平板之间插入一个长金属铲子，轻轻转动铲于将玻璃平板橇起使之分开，凝胶应贴在下面的玻璃平板，如果贴在上面的平板，则将它翻转过来。 26. 从插有铲子的一边馒慢提起上面的平板，遂渐增加角度直至上层平板完全与凝胶分离。 27. 一旦平板分离后，取去另一边的垫片及除去凝胶周围多余的聚丙烯酰胺碎片。 28. 如果样品含32P或33P，固定步骤可用可不用。如果样品含33S，直接将凝胶连同玻璃平板一起放入浅托盘中，轻轻覆盖一层约2cm的5%乙酸/5%甲醇固定液，浸泡10~15min，不时轻轻摇动托盘使凝胶与玻璃平板松开。 29. 将疑胶重新置于平板上，靠吸力或重力除去固定液注意保持凝胶处于平极的中央，小心从托盘中将平板连同凝胶取出，放在工作平台上。 30. 将两张干的转印纸，叠齐如同一张一祥，从凝胶的一端开始缓慢地向另一端放下，贴在凝胶的表面，小心防止在纸和凝胶间形成气泡。 31. 从平板上剥起转印纸，凝胶应和它一起被揭起，逐渐卷起纸，而凝胶就同它一起被剥离平板。 32. 将滤纸和凝胶放在预热的干胶机中，上面覆盖一张保鲜瞑，80℃处理20min~1h，使凝胶彻底干燥。 33. 从干胶上揭去保鲜膜，将干胶放在X光曝光盒中，KodakXAR-5X光胶片直接与凝胶接触，室温放射自显影，经足够时间曝光后（一般需过夜）取出X光胶片并冲印。 其他 |
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