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RNA的Nouthern印迹和狭线杂交分析实验一甲醛琼脂糖凝胶电泳
蚂蚁淘
/发布时间:1533403710 /浏览量:200
| 实验材料 | RNA 试剂、试剂盒 | DEPCMOPS甲醛琼脂糖乙酸铵NaOHNaClTris·Cl磷酸钠溴化乙锭SDS 仪器、耗材 | 离心机电泳仪培养箱紫外线透照仪杂交炉
实验步骤 | 1. 用72ml水溶解1g琼脂糖，在水浴中冷至60℃时，移至通风橱中加入10×MOPS电泳缓冲液和18ml12.3mol/l甲醛。 2. 铺制凝胶使之凝固，拔去梳子，将凝胶放进电泳池，加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1mm左右。 3. 将每份样品的体积用水调整至11μl，然后加入： （1）5μl 10×MOPS电泳缓冲液 （2）9μl 12.3mol/l甲醛 （3）25μl 甲酰胺 （4）在漩涡混合器振荡混匀，并在微量离心机中短暂离心5~10s回收液滴，然后在55℃保温15min。 4. 加入10μl醛加样缓冲液，在旋涡混合器中振荡，并在微量离心机中稍加离心以回收液滴。 5. 每分样品在一对加样孔中分别加入0.5~10μgRNA样品，以便可取半片凝胶进行染色显。 6. 在5V/cm电压降下电泳至溴酚蓝染料泳动了凝胶长度的一半或三分之二。 7. 用溴化乙锭染色 （1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。 （2）放置于无RNa酶的玻璃平血，加入足够量的0.5mol/l乙酸铵覆盖，浸泡20min换液再泡20min以除去甲醛。 （3）倾去液体，加入含0.5μl/ml溴化乙锭的0.5mol/l 乙酸铵，染色40min。 （4）必要时以0.5mol/l乙酸铵脱色1h。 8. 用吖啶橙染色 （1）取出凝胶，切下需要染色的泳道。 （2）在含10μg/l吖啶橙的1.1mol/l 甲醛/10mmo/l磷酸钠中染色2min。 （3）在不含吖啶橙的同样液体中脱色20min。 9. 在紫外线透照仪中使凝胶中的RNA显迹，沿凝胶的边缘放一把尺子拍照，以便随后能确定膜中的条带。 10. 将非染色的部分凝胶放置于无RNA酶的玻璃平皿，加足够的去离子水浸洗几次以除去甲醛。 11. 凝胶浸泡在10倍体枳的0.05mol/lNaOH/1.5mol/lNaCl中30min，使RNA部分水解。 12. 接着浸泡于10倍体积的0.5mol/lTris·Cl（pH7.4）/1.5mol/lNaCl缓冲液中和30min。 13. 将溶液换成10倍体枳的20×SDS，浸泡45min。 14. 在玻璃或塑料平皿中放置一比凝胶略大的矩形海绵（必要时，可并排放两块或更多）加入足够的20×SDS以使海绵半淹没在液体中。 15. 构筑转移平台，剪3张与海绵同样大小的Whatman3MM滤纸，放在海绵表面，并以20×SDS润湿。 16. 把凝胶置于滤纸表面，用玻璃吸管在其表面滚动挤压去除气泡，切4条塑料保鲜瞋覆盖在凝晈的边缘。 17. 剪一片与凝胶暴露面枳大小相当的尼龙膜或硝酸纤维素胶膜，在一个无RNA酶的玻璃平皿中加入约0.5mm深的去离子水，将膜漂住水面使之润湿，直至膜沉没在水中。 18. 如果是尼龙膜，只需让膜在水中泡上5min，如杲是硝酸纤维素膜，换成20×SDS再浸泡10min。 19. 将润湿了的膜放在凝胶表面，排去气泡，以20×SDS洗膜表面。 20. 切5张与膜大小相当的Whatman3MM滤纸，放于膜的表面。 21. 然后将切得如膜大小相当的纸巾整齐地堆放在滤纸的表面，高约4cm。 22. 在纸堆的顶部放一块玻璃平板，压一重物（0.2~0.4kg），放置过夜。 23. 拆卸转移装置，回收膜和压扁了的凝胶，在膜上用铅笔标上加样孔的位置和方向。 24. 用2×SDS洗膜，然后放在一张Whatman3MM滤纸上，让膜完全干燥 25. 硝酸纤维素膜的处理：将膜夹在两张Whatman3MM 滤纸中，80℃真空烤膜2h。 26. 尼龙膜的处理：如上述方法烤膜或将干的膜包在能透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外线透照仪照射合适的时间。 27. 如需要的话，凝胶可按步骤7或8操作，用溴化乙锭或吖啶橙染色以检查转印效率，或在含0.03%（w/v）亚甲蓝的0.3mol/lpH5.2的乙酸钠缓冲液中染色45s，在水中脱色2min。 28. 制备放射比活在108 dpm以上的寡核苷酸探针，并除去未标的寡核苷酸。 29. 用6×SSC液润湿携带RNA的膜。 30. 将膜带RNA的面朝上，放入杂交管中，毎10cm2 面积加入1ml甲酰胺预杂交液/杂交液，杂交管在杂交炉中旋转保温3h温度设定在42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）。 31. 如果是双链探针的话，需在水浴或加热器中加热至100℃，保温10min，移至冰上。 32. 吸所需要体积的探针加入杂交管中，在杂交炉中于42℃（DNA探针）或60℃（RNA探针）旋转过夜。 33. 倒出杂交液，按以下程序依次洗膜： （1）2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min。 （2）0.2×SSC/0.1%SDS室温旋转洗涤2次，每次5min（低严谨度洗涤）。 （3）于42℃预热0.2×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15min（中严谨度洗涤，可选）。 （4）于68℃预热0.1×SSC/0.1%SDS，在此温度下洗涤2次，每次15min（高严谨度洗涤，可选）。 34. 在室温以2×SSC洗膜，吸干多余液体，盖上可透过紫外线的塑料保鲜膜，并进行放射自显影。
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