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回复:时间:2021-08-18
可以,以下时RNA纯化1)用酚氯仿抽提:这两种有机溶剂合用,比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚,先加入酚后加入氯仿。①核酸样品置有盖小离心管中,加入等体积的酚/氯仿(如有20ul样品,则加入10ul酚10ul氯仿。②旋涡混匀管内容物,使呈乳状。③12000×g室温离心15秒。④水相移入另一离心管,弃去两相界面和有机相。⑤重复步骤①-④步操作,直至两相界面上见不到蛋白质为止⑦按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸2)2-8度,离心,10500rpm/min,15min,取上清,用200ul在20ul刻度使用,小心不要使界面混淆,剩余界面上不要)3)上清中加入等量的异丙醇(一般是0.5:1),颠倒5次(用200ul枪加小心),室温静置10min7. 2-8度离心,10500rmp/min,10min,弃上清8. RNA洗涤:75%酒精(这次用的100%。未影响)1ml沉淀,轻轻弹其底部(直接放入-70度冰箱可以长期保存,静置几秒钟9.2-8度离心,8500rpm/min,5min ,弃上清10. 取出滤纸,将EP管敞开放在滤纸上,管口向酒精灯(不要完全干燥,不好溶解)11.DEPC水溶解(30ul,可变),分装,2ul电泳,2ul比色,其余5ul分装至于手套中冻于-20度中结果仍旧不是很理想,测得的OD260/280=1。所以怀疑有DNA污染:1.使用TRIZOL再抽提一次2.除去DNA的分子克隆书上的方法:1.材料:TE缓冲液(10mmol/lTris.HCL,PH7.4,1mmol/lEDTA,ph8.0100mmol/Lmgcl2/100mmol/Ldtt2.5mg/ml DNA酶1胎盘核糖酸梅抑制剂 DNA酶反映中止液2.步骤:3.1。冰预中配置:100mmol/l MGCL2/100mmol/l DTT10ul2.5mg/mlDNA酶0.2ul核酸酶抑制剂0.1ul(25-50U/UL)TE39.7ul加入RNA 反映液中,混匀。37°温预15min3加入25ulDNA酶反应中止剂,以酚/氯仿/异丙醇&氯仿/异丙醇抽提一次4,加入325ul乙醇再冰上沉淀15-30min,-20过夜结果;使用TRIZOL再提取一次后,浓度较低,纯化后有纯度升高。RNA:OD260=0.695.OD280=0.410OD260/OD280=1.8我的步骤,以及经验
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