1.实验前准备：

1.1材料

0～12h果蜗胚胎

1.2试剂

脱色洗液：50％（V/V）家用漂白剂的蒸馏水溶液

胚胎洗液：0.7％（m/V）NaCl/0.04％（V/V）TritonX－100

缓冲液B

缓冲液A

1mol/LNaOH

0.1mol/LCaCl₂

7200U/ml微球菌核酸酶储液

10mmol/L和500mmol/LEDTA

10％（m/V）SDS

5mol/LNaCl

24：1（V/V）氯仿/异戊醇

线形5％～30％蔗糖梯度

T₅₀E₄缓冲液：50mmol/LTris·Cl（pH7.9）/4mmol/LEDTA

羟磷灰石树脂（如BioGelHT胶；Bio-Rad）

加有0mol/L、0.35mol/L、2.5mol/LNaCl的轻磷灰石层析缓冲液

核心组蛋白储存液

1.3耗材

BCA分析试剂盒（Pierce）

细尼龙网（如SefarAmer1ca03－08/37）称量皿

YamatoLH－21匀浆器（可选；Potter－Elvehjem匀浆器）

用于SorvallGSA转子（或相当的物品）的500ml离心管

Mira布（Calb1ochemNovab1ochem）Sorval1Superspeed离心机，带有GSA和SS-34转子（或相当的物品）

Beckman超速离心机，带有SW－28转子及适用的离心管

12000～15000及3500MWCO透析管

FPLC装置

2.细尼龙网在支撑物上放好，将约100g0～12h果蝇胚胎放在网上。用冰冷的水彻底冲洗以去除酵母和其他污染物。

3.将胚胎浸泡在3L室温的脱色洗液中90S。用1L室温的胚胎洗液快速清洗胚胎。再用蒸馏水彻底冲洗。将胚胎放在尼龙网上，透过网用纸巾吸干胚胎上的水，然后转移到称量皿中称重。

4.将胚胎转移到一个玻璃烧杯中。每1g胚胎用3ml缓冲液B重悬。将重悬液倒入YamatoLH－21匀浆器中以1000r/min匀浆，流出液经Mira布过滤收集到GSA管中。

5.每1g胚胎用1ml缓冲液B冲洗原来放置胚胎的烧杯。如步骤3，将冲洗液倒入YamatoLH－21匀浆器中，流出液经Mira布过滤收集。每1g胚胎用1ml缓冲液B再重复一次。4℃，10000g（GSA转子8000r/min）离心过滤液（每克胚胎5ml缓冲液）20min。

6.弃上清。用200ml缓冲液A重悬松散的核。4℃，10000g（GSA转子8000r/min）离心10min。

7.弃上清。小心不要碰到淡黄色的沉淀，用100ml缓冲液A重悬核。4℃，10000g（GSA转子8000r/min）离心10min。

8.弃上清。用30ml缓冲液A重悬核。

9.将10ul重悬的核与990ul1mol/LNaOH混匀稀释。测定溶液的260nm光密度（OD₂₆₀）用缓冲液A稀释核重悬液至100OD₂₆₀单位/ml。

10.按如下步骤进行微球菌核酸酶消化测试：

10.1在1.5ml微量离心管中加入1ml核重悬液并预热到37℃。

10.2加入10ul0.1mol/LCaCl₂和2ul200U/ml微球菌核酸酶储液。

10.337℃温育。于1、2、4、6、8、10、15、20min，分别取出100ul并在其中加入2.5ul500mmol/LEDTA终止反应。

11.每个溶液中均加入30ul水和2010％SDS。充分混匀后加入40ul5mol/LNaCl。混匀，用200ul氯仿/异戊醇（24：1）抽提每个溶液。

12.从以上各溶液中取4ul水相与琼脂糖凝胶加样缓冲液混合。各个样品（代表步骤9中的各个时间点）进行1％琼脂糖凝胶电泳。用溴化乙锭染色并拍照。选取产物大多为约2000bp片段的时间点。

13.37℃预热核重悬液，加入1/100体积的0.1mol/LCaCl₂。加入1/500体积的200U/ml微球菌核酸酶并转动摇匀。37℃温育，偶尔转动摇晃，温育的时间即为在步骤8～11确定的时间。加入1/50体积的500mmol/LEDTA终止消化并置于4℃。

14.4℃，12000g（SS－34转子10000r/min）离心10min。弃上清。加入9ml10mmol/LEDTA重悬沉淀，加入1ml5mol/LNaCl涡旋混匀5min。

15.4℃，12000g（SS-34转子10000r/min）离心5min。储存上清，取10ul与990ul1mol/LNaOH混匀并测定OD₂₆₀。

16.在SW28管的蔗糖梯度缓冲液中制备5％～30％蔗糖线性梯度（各18～20ml），其上加入≤500OD260单位的上清液。4℃，90000g（SW28转子26000r/min）超速离心16h。

17.将梯度以每管2ml回收，每个回收产物取8进行15％SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色并脱色。将含有核心组蛋白峰的回收片段集中，在12000～15000MWCO透析管中于4℃对2LT50E4缓冲液进行透析2次，每次2h。

最好将每个梯度的回收片段都收集到50ml锥形管中。如果在含蔗糖的回收片段中有悬浮的碎片，透析后离心去除。回收的经消化的染色质可以在4℃保存几个月，并且核心组蛋白的完整性不会丧失。如果选定的组分要进一步纯化，小心避免含有组蛋白H1的组分的混入。

18.取10ul经透析的样品与990ul1mol/LNaOH混匀并测定OD₂₆₀。每1.5mgDNA需1ml柱体积，计算需要多少体积的羟磷灰石树脂。

19.选择适当大小的羟磷灰石柱，装在FPLC上，用3倍柱体积的无NaCl的HA层析缓冲液平衡柱。

20.将透析的样品上到柱上，用3倍柱体积的无NaCl的HA层析缓冲液清洗。用3倍柱体积的含0.35mol/LNaCl的HA层析缓冲液清洗以洗脱除组蛋白外的其他DNA结合蛋白。

21.用2倍柱体积的含2.5mol/LNaCl的HA层析缓冲液洗脱核心组蛋白。

22.取2ul蛋白峰组分进行15％SDS-PAGE电泳分析。考马斯亮蓝染色并脱色。将含有核心组蛋白峰的回收组分集中，在3500MWCO透析管中于4℃对2L核心组蛋白储存缓冲液进行透析2次，每次2h。

23.透析后，使用BCA分析系统确定组蛋白的浓度。分装于微量离心管中，并在液氮中速冻。－80℃可以保存几年。