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PEI 沉淀法分级分离可溶性提取物实验
蚂蚁淘
/发布时间:1533849237 /浏览量:145
| 试剂、试剂盒 | 提取液硫酸铵聚乙烯亚胺缓冲液A二硫苏糖醇 仪器、耗材 | Tissuc-TearorTM匀浆器
实验步骤 | 材料与设备 提取液〔0.2%脱氧胆酸钠(DOC)上清，见实验1，P.146~147〕 Tissuc-TearorTM匀浆器（FisherScientific15-338-55) 硫酸铵(AMS) 试剂 聚乙烯亚胺(PEI)(10%储液,pH7.9) 缓冲液A 缓冲液A+0.3mol/LNaCl 缓冲液A+0,9mol/LNaCl 二硫苏糖醇(DTT)(0.1moVL) (配方，见“试剤的配制”PP.I84~189) 操作程序 1)将0.75ml10%PEI液加入体积约为24ml的可溶性提取物(0.2%DOC上清)中,使PEI终浓度为0.3%。混合后，4°C下静置15min。 方案补充实验：加PEI前，取6x50ul的0.2%DC上清，用以确定沉淀σ32和RNA聚合酶所需的PEI量（见p.174)。加入PEI后，再取6X50ul的PEI悬液，用以确定从PEI沉淀物洗脱σ32和RNA聚合酶所箱的盐量(见P.175)。 2)悬液于4°C、5000r/min离心10min。上清弃去前留样（样品E)。保留沉淀物。 3)对PEI沉淀物，加20ml缓冲液A+0.3mol/LNaCl,在低盐浓度下洗涤沉淀物。用Tissue-Tearor匀浆器剧烈重悬沉淀物后，于4°C下至少静置10min。 4)悬液于5000r/min离心10min。上清弃去前留样（样品F)。保留沉淀物。 注：低盐洗涤可从PEI沉淀物中洗掉某些蛋白质，而留下游离的和复合于核心RNA聚合酶的σ32。这一步大致等同于从DEAE-Sepharose柱的低分辨率的盐洗脱。 5)对PEI沉淀物，加20ml缓冲液A+0.9mol/LNaCl，进行高盐洗脱。用TissueTearor匀浆器剧烈重悬沉淀物后，于4°C下至少静置10min。 6)悬液于4°C、13000r/min离心10min。倾出并保留上清（是为高盐洗脱物)。取样（样品G)。 注：高盐洗脱，释出复合于核心RNA聚合海的σ32,而其他物质（大部分为核酸）则留于沉淀。沉淀会相当多。 7）为除去髙盐洗脱物中的PEI,每20ml慢慢加入7.6gAMS,得55%饱和AMS溶液。不断搅拌混合，直至所有的AMS全部溶解。于冰上静置过夜（或至少30min)。再加20ul0.1mol/LDTT,使DTT终浓度为0.1mmol/L。 8)4°C、13000r/min离心10min。上清弃去前留样（样品H)。沉淀物于冰箱保存过夜。 注：AMS是通过增强疏水作用而使蛋白质沉淀的。55%饱和AMS帑液可沉淀出大部分蛋白质，而将PEI和少量蛋白质留于上清。达到沉淀所需的AMS量随蛋白质及其浓度而异。
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