实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1.对每一组dscDNA（A和B）配制2个限制性内切核酸酶消化反应（AluI和AluI＋Rsal）：

30ngdscDNA

3ul10×AluI缓冲液

10UAluI或10UAluI＋10URsaI

加水到30.0ul。

37℃温育过夜，确保完全消化。

最好使用产生平端的酶。如果不是产生平端的酶，需要另外补平或削平。

2.65℃温育超过10min失活内切酶。

3.激酶处理寡核苷酸a1和b1，使用如下反应体系（每个反应体系25ul）：

18.0ulH₂O

2.5ul10mmol/LATP

2.5ul10×T4多聚核苷酸激酶缓冲液

1.5ul3ug/ul的寡核苷酸a1或b1

0.5ul10U/ulT4多聚核苷酸激酶

37℃温育60min。

4.65℃温育20min失活激酶。

5.加入1.5ul的寡核苷酸a2或寡核苷酸b2形成a1/a2或b1/b2连接子。混匀，最高速离心。45℃温育10min。

6.在0.5ml的PCR管里，用合适的连接子为每组cDNA配制连接反应（130ul每个反应）：

63ulH₂O

13ul10×T4DNA连接酶缓冲液

30ul40％PEG8000

1ul15mmol/LATP

10ulAluI消化的cDNA

10ulAluI/RsaI消化的cDNA

2ula1/a2或b1/b2连接子

1ul10U/ulT4DNA连接酶

混匀，16℃温育2h。

7.将反应管放于冰上超过10min。

8.根据厂家说明书准备SephacrylS-300离心柱。

9.每个连接反应中加入1ul75mmol/L的ATP和1ulT4多聚核苷酸激酶。37℃温育30min。

10.用1倍体积的25：24的苯酚/氯仿和氯仿依次抽提连接反应。

11.连接产物离心过SephacrylS-300离心柱，除去未连接的连接子，用BeckmanAccUSPinFR离心机的吊桶转子室温，400g离心2min。

12.两组cDNA，各配制50ulPCR反应体系：

35ulH₂O

5ul10×TaqDNA聚合酶缓冲液

3ul25mmol/LMgCl₂

1ul10mmol/L4dNTP混合物

0.5ul2.5ug/ul寡核苷酸a2或寡核苷酸b2

5ul0.2ng/ul连接好的cDNAA或cDNAB

0.5ul5U/ulTaqDNA聚合酶

加入几滴无菌的PCR级的矿物油覆盖反应体系。

13.用下面的PCR程序扩增cDNA：

30个循环：

1min94℃（变性）

1min50℃（复性）

2min72℃（延伸）

25s72℃（自动延伸）

对于没有自动延伸的热循环仪，延长延伸时间为2～4min。

14.用琼脂糖凝胶电泳分析5～10ul扩增好的cDNA，确定扩增cDNA的大小范围（150bp～1.5kb，大部分为250bp）

15.对两组扩增好的cDNA，各配制以下由放射性标记的测试cDNA的PCR反应体系（每个反应体系100ul）：

77ulH₂O

10ul10×TaqDNA聚合酶缓冲液

6ul25mmol/LMgCl₂

2ul10mmol/L4dNTP混合物

1ul稀释的［³²P］dCTP

1ul2.5ug/ul寡核苷酸a2或寡核苷酸b2

2ulA₀或B₀cDNA（约0.4ug）

1ul5U/ulTaqDNA聚合酶

加入几滴无菌的PCR级的矿物油覆盖反应体系。

16.对两组扩增好的cDNA，各配制3或4个由生物素标记的驱动cDNA的PCR反应体系（每个反应体系100ul）：

73.3ulH₂O

10ul10×TaqDNA聚合酶缓冲液

6ul25mmol/LMgCl₂

6.7ul驱动dNTP

1ul2.5ug/ul寡核苷酸a2或寡核苷酸b2

2ulcDNAA₀或cDNAB₀（1～５ng）

1ul5U/ulTaqDNA聚合酶

加入几滴无菌的PCR级矿物油覆盖反应体系。

17.用步骤13中的PCR扩增程序进行测试和驱动cDNA的合成。

18.按厂家说明，用商业化的阴离子交换PCR离心柱（Qiagen）纯化扩增的cDNA，去除未掺入的核苷酸、引物和盐。

19.用分光光度计定量产物核酸。

20.配制2个杂交反应（［³²P］An-Bio-Bn和［³²P］Bn-Bio-An）。在一个1.5ml硅烷化的微量离心管里，用乙醇沉淀1ug放射性标记的测试DNA和20ug的生物素标记的驱动DNA，不要冷冻。风干沉淀，当沉淀刚刚干时，用吸头轻轻吹吸，重新溶于5ulHEPES缓冲液。用手提式盖格计数器检测重新溶解的核酸溶液。

21.转移重新溶解的DNA到一个0.5ml的PCR管里。加入5ul68℃的2×杂交缓冲液进行差减杂交。轻轻吹吸混匀，加入数滴无菌的PCR级的矿物油覆盖DNA溶液。最高速离心几秒。

22.把两个管子在95℃加热10min，然后在1h内慢慢冷却到68℃，并继续在68℃温育2h（快速杂交）。

23.混合7ul1mol/L的NaCl和140ulHEPES缓冲液，加热到68℃。加入到杂交反应中稀释反应。混匀，最高速简单离心。冷却到室温。

24.每管中取出5ul，保存（用作酚抽提前的总量计算）。

25.每管中加入15ul链霉亲和素，涡旋混匀，室温温育5min。

26.每管用等体积的25：24的苯酚/氯仿抽提。保留水相转移到新的管里。

27.每管的水相中加入10ul链霉亲和素。混匀，室温温育5min。

28.用苯酚/氯仿和氯仿各抽提两次。测量每管的水相体积。

29.每管中取出5ul，保存（用作酚抽提后的总量计算）。

被去除掉的测试cDNA的百分比用以下等式估算：

％去除的测试CDNA＝100一（酚抽提后总量×100/酿抽提前总量）

30.用An或Bn测试cDNA和合适的驱动cDNA重复差减的过程（步骤15～29）。驱动cDNA的选择由差减的策略决定。用An或Bn驱动cDNA进行快速杂交（2h），用A₀或B₀驱动cDNA进行长时间杂交（30～40h）。差减的进程用隙缝斑点杂交检测。

31.用步骤13的程序扩增5ul差减cDNA（An和Bn）。用一个商业化的阴离子交换PCR离心柱纯化PCR产物（如Qiagen）。

32.用在连接子上有剪切位点的合适限制酶（针对于这里所用的连接子，如Ec0RI和EcoRV）消化cDNA。

33.苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化消化的cDNA。

34.把DNA连接到合适的载体中（如EcoRI或EcoRV切开的pBluescript）。

35.转化载体到感受态细菌里。

36.铺板培养差减文库。

值得先通过滴定文库以获得单克隆。确定含插入片段克隆的百分比和插入片段的大小也很重要。

插入片段应当是250bp左右。如果插入的片段＞500bp，则可以认为是插入了两个片段。

37.从每个起始滤膜制备4个重复的印迹。

38.按照厂家说明，变性、中和和交联印迹。

39.用差减探针杂交这些重复的滤膜。

40.从库里随机（如果估计库里绝大多数是差异表达的基因）或按照探针的杂交结果挑取50～100个差异表达的克隆。准备小量的质粒DNA。

41.对每个质粒里的插入片段进行测序，把含有相同序列的克隆归在一起。

42.用起始组织的RNA分析［如Northern印迹、RNase保护分析、定量RT-PCR或者原位杂交确定这些克隆是否确实是差异表达的。