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核纤层和富含核纤层组分的制备实验一果蝇胚
蚂蚁淘
/发布时间:1533494006 /浏览量:54
| 实验材料 | 果蝇胚 试剂、试剂盒 | 溶液E 仪器、耗材 | 研杵匀浆器
实验步骤 | 胚收集和制备 1.可用任一种方法收集果蝇胚（OregonRP2或任何其他的野生系）。 制备匀浆 2.直接在9倍体积的抽提缓冲液（溶液E)中融化冻存胚。 溶液E： 250mmol/L蔗糖 50mmol/LNaCl 50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，(25℃) 5mmol/LMgCl2 1mmol/LPMSF 1mmol/LTPCK 2.5mmol/LNEM 3.胚完全融化后在带紧密结合研杵（A)的Dounce匀浆器中推捣4次使之破碎，用4层溶液E浸透的120μm尼龙网过滤匀浆。 细胞核组分粗品的纯化 4.过滤后，2000g离心匀浆10分钟。 5.吸出上清，沉淀部分（含细胞核）重悬浮于0.5倍体积的溶液E中。 6.再加4.5倍体积的溶液E稀释细胞核悬液，按上述方法（2000g10分钟）离心。 7.重复一次步骤5和6（重悬浮、稀释、离心）。 细胞核的热稳定/核酸酶消化处理 8.将最后一次2000g离心后的细胞核用带宽松结合研杵（B)的Dounce匀浆器重悬浮于0.5倍体积的20mmol/LTris-HCl (pH7.5)，5mmol/LMgCl2溶液中。 9.再加0.5倍体积的上述溶液，然后加入终浓度分别为8μg/ml和10μg/ml的RNA酶A和DNA酶Ⅰ。 10.将重悬浮后加核酸酶的细胞核在37℃孵育5分钟。 用非离子活化剂和NaCI抽提热稳定的、核酸酶处理过的细胞核 11.2000g离心10分钟回收热稳定和核酸酶消化的细胞核。 12.向沉淀中（含热稳定的核酸酶处理的细胞核）加入0.9倍体积的溶液F，用带宽松结合研杵（B)的匀浆器重悬浮。 溶液F： 292mmol/L蔗糖 10mmol/LTris-HCl(pH7.5) 0.1mmol/LMgCl2 13.加0.1倍体积的20%(w/v)TritonX-100到细胞核悬液中，使TntonX-100的终浓度为2%(w/V)，冰上孵育10分钟。 14.将经过热稳定，核酸酶处理，非离子活化剂抽提的细胞核在2000g离心10分钟。 15.用带宽松结合研件（B)的Dounce匀浆器将含有热稳定的，核酸酶处理和非离子活化剂抽提过的细胞核的沉淀组份重悬浮于0.45倍体积的溶液F中。 16.加0.05倍体积的1mol/LTris-HCl(pH7.5)，然后加0.5倍体积的2mol/LNaCl，使NaCl终浓度为1mol/L，将悬液在冰上孵育10分钟。 17.10000g离心10分钟回收不溶复合物，重悬浮沉淀，像15和16步中那样再次用NaCI抽提。 18.10000g离心10分钟将核基质-核膜孔复合物-核纤层组份收集于沉淀组分中，用溶液F重悬浮。
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