一、分离

1.用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织，然后用D-PBSA浸洗。

2.称重前，与肌纤维平行将切除活检组织切成片，用冲洗。

3.将组织片平行放入Petri培养皿盖内，切成较薄的柱状组织块，然后切成1mm³小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织剪成小块，应避免挤压组织。

4.用D-PBSA浸洗组织块，静置后吸去上清液。

5.在37°C条件下，用链酶菌蛋白酶液（0.15%链酶菌蛋白酶（SigmaP-6911）、0.03%EDTA（Merck8418）、20IU/ml青霉素和20μg/ml链霉素（0.4%EurobioPES3000），用HamF12或D-PBSA配制，100ml）消化组织块1h。每1~3mg组织块用15ml链酶菌蛋白酶液。每间隔10~15min轻轻摇晃试管。

6.孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来，培养液会逐渐变得浑浊。

7.让组织块沉到试管的底部，形成沉降的组织块（P1)和上清液（S1）。

8.用孔径为100μm的尼龙网将S1滤入20ml离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液，使细胞混悬。

9.离心（350g，8~10min）后，吸去上清液。

10.准确加入10ml生长培养液（HamF12，添加20%FBS（Gibco011-06290），200ml），用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后，用血细胞计数板计数细胞。

11.用生长培养液稀释细胞悬液，以约1.5×10⁴个/ml的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从1g健康供体活检组织约获得1~2×10⁵个细胞。

12.将15ml消化液加入P1，在37°C水浴中孵育组织块30min，并定时摇晃。

13.用吸管吹打细胞悬液，使细胞分散。然后，用尼龙网过滤细胞悬液。用20ml生长培养液浸洗滤网。

14.离心（350g，8~10min）后，计数细胞，按上述方法接种细胞。

15.将培养瓶移入湿润的培养箱，在37°C和5%CO₂的条件下培养细胞。

二、维持培养

16.接种后24h很轻微地换培养液，以后每3~4d换液1次。细胞主要向着分化生长。人成肌细胞的生长分3期，培养后4~6d增殖达髙峰；8d左右排列成行；10~12d细胞融合和形成肌管增多。然而，必须记住一些细胞可能分化较早，绝大多数细胞分化时一些细胞仍处于增殖状态。

三、传代培养

17.将少量EDTA轻轻注在细胞上面后立即吸去。

18.加入0.25%胰蛋白酶液，足以在细胞上面形成一薄层。

19.当细胞去附着时，加入5~10ml完全生长培养液，用吸管很轻微地吹打细胞，然后离心（350g，10min）。

20.计数细胞，按一定密度种植细胞。