1.准备下列试剂和材料：

DMSO（组织培养级）

平底96孔板

多道移液器

无菌多道移液器容器

ES生长培养基

ES分化培养基

无Ca²⁺和Mg²⁺PBS

胰酶溶液

2X冻存液

2.PBS冲洗96孔板上的ES细胞两次，200μl/孔。

3.每孔中40μl胰酶溶液，37℃孵育5分钟。显微镜下观察细胞脱落和分离情况。

4.胰酶消化的同时，准备2X细胞冻存液（FCS+20%DMSO）。

5.在胰酶消化细胞中加60μl培养基，吹吸分散细胞。

6.在新的无菌96孔板每孔中加50μl2X细胞冻存液。

7.取50μl胰酶消化的ES细胞，直接加入冻存液中，吹吸一次混匀。细胞转移到-80℃冻存，直至鉴定出具有预期表型的克隆。

8. ES分化培养基稀释剩余细胞，悬滴培养。

9.体外分化后，鉴定具有预期lacZ表型的克隆，融化相应的冻存细胞，用于进一步分析。