2.3小鼠胚胎饲养细胞（MEF)的制备

最广泛地用于支持hES的伺养层细胞来自小鼠胚胎[丁]^〇1113〇1161&1,，1998;Reu-binoffetal.，2000]，如小鼠胚胎饲养细胞（MEFs)，尽管它们可能是最原始的间叶细胞的前体细胞。

每一种hES细胞系在不同的词养层细胞上的生长可能不同，这点要注意，对于高效率的增殖有些饲养层细胞比另外一些细胞更合适，通常要传5〜10代以确保细胞适应于新的伺养细胞。始终要做到只要细胞培养标准条件改变，就要对细胞的核型稳定性和多能性进行严格的核查。方案2.1介绍了原代MEF细胞的分离培养。

2.3.1原代培养

小鼠胚胎饲养细胞能够从妊娠〗15.5——16.5天的小鼠胚胎（E15.5〜E16.5)中分离出来，培养过程易于生长，是一种可靠的、持续的饲养细胞的来源，并能在液氮中维持很长时间。MEFs通常是在复苏之后2〜5天使用。方案2.1是由Nagy等人的方案修改而来[2003]

方案2.1小鼠胚胎饲养细胞（MEFs)的原代培养

试剂与材料

无菌或无菌制备

□MEFM(见2.2.3)

□无Ca2+和Mg2+磷酸盐缓冲液（PBSA)

□胰蛋白酶，0.25%,用Gibco溶液A配制（参见2.9节）

□乙醇70%

□75cm2培养瓶

□l0cmPetri培养皿，塑料的，非组织培养级别

□带螺盖的离心管，15ml和50ml

□用于解剖的镊子和解剖刀（使用之前高压消毒并保存在70%酒精中)

□可更换的解剖刀片，11号

非无菌

□计时妊娠鼠，15.5〜16.5天（经典常用的小鼠品系包括SV129和C57：BL)

步骤

(a)处死妊娠15.5〜16.5天的小鼠。

(b)用70%酒精擦洗鼠的腹面。

(c)剪开皮肤和组织暴露子宫。

(d)取出子宫角并放到含有PBSA的10cmPetri塑料皿里。

(e)用解剖刀从胚囊中取出胚胎，丢弃其他所有的组织包括胎盘以及胎膜。

(f)取出含有脑组织的头的上部并丢弃。

(g)沿着从头到尾的中轴从幼崽前端开始切开胚胎进行解剖，暴露及丢弃内部器官。

(h)把胚胎剩余部分放在50ml离心管里用PBSA洗4遍。

(i)把胚胎剩余部分转人干净的10cmPetri皿中，去掉PBSA，把胚胎用新的解剖刀切成2mm大小的小块。

(j)把切碎的胚胎放到15ml离心管里，加人IOml0.25%的胰蛋白酶，在37°C孵育10〜20min。

(K)使小块沉淀下来，从孵育管中取出5ml胰蛋白酶以及分散的细胞，并且放到无菌的50ml的离心管里。

(l)加人等体积的MEFM抑制胰蛋白酶活性。

(m)再加人5ml0.25%胰蛋白酶到原先的含有胚胎的15ml离心管里，并在37°C再孵育10’〜20min

(n)重复步骤（k)，（I),(m)，大约进行5次孵育，将所有加人的胰蛋白酶以及分散的细胞放人同一个50ml离心管。只有没溶解的软骨将被留在原先的含有胚胎的15ml管中。

(O)用力地分散胰蛋白酶消化的细胞悬液并允许剩余的小块沉淀。

(P)取出并保存上清液，去除沉淀。

(q)离心上清液，l000g，5min

(r)用IOmlMEFM重悬沉淀并用台盼蓝计数活细胞数

(s)每个160cm2培养瓶接种5XIO⁶细胞，再加人IOmlMEFM。

(t)在37°C、5%C02温箱里孵育过夜。

(u)第二天，用20ml的新鲜的MEFM培养基置换旧的培养基以去除细胞的碎片。

(V)在冻存之前使细胞长到80%〜90%汇合。

注意：要确保MEFs细胞完全没有被任何微生物所污染，每次从小鼠胚胎新制备MEFs,要在无抗生素的培养基中至少连续传]5代，在这个时期如果没有观察到微生物污染，那么早期传代的细胞就可以扩增，并大量分装冻存起来，随后能够安全地用于日常HES细胞的增殖。

2.3.2MEFs的继代培养

为了维持细胞库的供应以及避免出现先前讨论过的细胞衰老，关注MEFs的传代次数是关键，简而言之，应该以较低传代次数（p〇〜p2)的细胞用于维持细胞库，以较高传代次数（P3和p4)的细胞用于制备无活性的可支持hES细胞的询养层。MEFs细胞在4代以后不能使用，这很重要，因为这个时期细胞已经衰老并可能很难扩增了。

MERs将在75cm2或225cm2的组织培养瓶中生长，这主要取决于需要多少飼养细胞（MEFs)s在制备饲养层细胞板时，一个75cm2培养瓶的MEFs如果灭活时达到80%汇合，就可以为2〜6个4孔培养板提供细胞.s.—个225cm2培养瓶的MEFs可用于大量储存细胞或者用来制备大量无活性的饲养层细胞板a,在进行hES细胞培养工作
之前.，有必要准备好充足的细胞储备供应，要确保饲养细胞不短缺。用225cm2培养瓶的大量传代将提供更快的MEFs细胞储备，因此方案2.2讨论了一个225cm2培养瓶的MEFs细胞传代的容量问题。为了工作容量进行传代，可将一个的培养瓶平均分为3份，而每个225cm2培养瓶的MEFs细胞应该按1:3的比例再产生三个225cm2培养瓶的MEFs用于储备。

方案2.2小鼠胚胎饲养细胞（MEFs)的传代

试剂与材料

无菌或无菌制备

□0〜3代的MEFs大约80%汇合，75Cm2或225cm2培养瓶

□MEFM(见2.2.3)

□明胶（高温高压灭菌，0.1%W/V

□胰蛋白酶，0.25%，溶于GffiCO溶液A(见2.9节)

□PBSA

□台盼蓝活性染色

□离心管，15ml

□组织培养瓶，3X225Cm2

□血细胞计数板

步骤

(a)从225cm2培养瓶中吸出培养基并用IOml的PBSA洗一次细胞。

(b)力口3ml的胰蛋白酶并在37°C孵育细胞4min。

(c)从孵箱里取出培养瓶并轻轻地敲击使MEFs进一步脱离培养瓶。

(d)加入6ml的MEFM，打散所有细胞确保没有粘连并防止成团。

(e)将培养基和悬浮细胞转人15ml离心管中。

(h)离心5min，lOOOg。

(g)把5ml0.1%明胶加人3个新的无菌的并将有MEFs传人的225cm2的培养瓶中，室温下与凝胶最少孵育5min。

(h)从离心管中取出MEFs并吸出培养基，敲击管壁分散细胞沉淀，用3ml新鲜的MEFM重悬。用吸管吹散细胞以确保细胞是单细胞悬液，这对于传代培养瓶中细胞的均一生长是必要的。

(i)从每个新的培养瓶中吸出5ml0.1%明胶，加入25mlMEFM培养基。

(j)把3ml的MEFs分配到3个225cm2培养瓶中。

(k)每个225cm2培养瓶中的细胞在下次传代时将继续分3份。

来自前三代的MEFs细胞（P0〜P3)的每一代都能冻存起来维持细胞的储备或者被传代为hES细胞的增殖提供饲养细胞（见2.3.5节）。

4代之后，MEFs应该被丢弃因为这些细胞可能衰老或发生改变。

2.3.3冻存小鼠胚胎饲养细胞

如果MEF细胞要用于hES细胞的培养过程，那就必须维持大量的、高质量的、不同代（PO〜P4)的MEFS冷冻贮存。传代次数早的细胞（p0〜p2)应该作为细胞储备的种子细胞，它们可以继续传代，再次冻存以提供大量的更高代次的细胞（p3〜p4)来维持hES细胞的日常生长。一个7Scm2培养瓶有80%汇合的MEF细胞将冻存产生一个冻存管的储
备细胞，一个225cm2培养瓶的细胞将冻存产生3个冻存管的储备细胞。

方案2.3小鼠胚胎饲养细胞的冻存

试剂与材料

无菌或无菌制备

□含有MEFs细胞的75cm2培养瓶或225cm2培养瓶，p0〜p4，8〇%〜90%细胞汇合

□MEFM(见2.2.3节）

□胰蛋白酶，0.25%，EDTA，溶于GIBCO溶液A(见2.9节)

□ESFBS

□DMSO

□PBSA

□离心管，15ml

□冻存管

步骤

(a)从含有MEFs细胞的培养瓶中去除培养基，并用PBSA洗一遍，每个75cm2培养瓶用5ml。

(b)每个75cm2培养瓶中加入胰蛋白酶lml，确保整个培养瓶的单层细胞都能被覆盖，37℃孵育4min。

(c)轻轻地敲打培养瓶使细胞进一步脱落。加入5mlMEFM终止胰蛋白酶反应，吹散5〜6次确保所有细胞没有粘连并防止成团。把含有MEFs的培养基转人15ml离心管。

(d)离心5min，IOOOg

(e)为冻存准备冻存管及写标签。标签内容应该包括MEFs细胞新传代的代次,曰期和任何可能需要的信息。在无菌条件下将lOOyDMSO加人备好的冻存管里。

(f)吸去上清，小心不要搅乱细胞沉淀。

(g)用ESFBS重悬细胞沉淀，每个75cm2培养瓶900uI，用塑料吸管打散细胞，确认细胞沉淀已混勻。

(h)把含有MEFs细胞的ESFBS转移到装有DMSO的冻存管里，立即储存到-80°C冰箱过夜，储存之前要彻底混匀。

(i)第二天，把冻存管放到液氮里长期保存。

2.3.4MEFs细胞的复苏

从长期液氮保存中复苏MEF细胞，用于补充MEFs的储备或者用于灭活处理后支持未分化hES的生长。

方案2.4复苏冻存的小鼠胚胎饲养细胞

试剂与材料

无菌或无菌制备

□一支MEFs冻存管

□MEFM(见2.2.3节）

□明胶，0.1%(高温髙压灭菌)

□组织培养瓶，75cm2

□水浴箱，设置在37°C

□吸管，Iml

步骤

(a)在75cm2培养瓶内加3ml0.1%明胶，覆盖细胞将要黏附的表面，室温孵育至少5min

(b)从液氮罐中取出一支MEFs冻存管。

(c)在37°C水浴箱中快速解冻细胞。

(d)把0.1%明胶从75cm2培养瓶中吸出并加入7ml的MEFM培养基。

(e)用Iml吸管把含有MEFs细胞的ESFBS/DMSO混合液从冻存管里转移到含有MEFM培养基的75cm2培养瓶中。

(f)在37°C孵育细胞过夜。

(g)第二天早上用新鲜的MEFM培养基替换7ml培养基去除残留的DMSO和细胞碎片。

(h)MEFs细胞生长达5天或细胞汇合达到80%，每2天换一次液。

2.3.5基于化学方法的MERs细胞失活

MEFs(P0〜P4)是一种快速分裂的细胞，因而在作为饲养细胞层使用之前需要抑制有丝分裂避免其过度生长。细胞分裂的抑制可通过放射和化学阻断方法获得，最普遍的是使用丝裂霉素C，它是一种为日常培养hES细胞而准备MEFs细胞的简单、有效的方法。

安全提示：对丝裂霉素C进行操作时一定要当心，因为它有遣传毒性。始终要戴手套，并且只能在II类通风橱（小的生物安全柜）内操作。

hES细胞的增殖需要使MEF细胞失活，一个75cm2培养瓶大约80%汇合的MEFs细胞通常能提供2〜4个（取决于MEFs细胞的产量）4孔板。方案2.5讨论了一75cm2培养瓶或一个225cm2培养瓶的MEFs细胞的失活处理，使用225cm2培养瓶需
要3倍试剂和培养基。

方案2.5小鼠胚胎饲养细胞的生长抑制

试剂与材料

无菌或无菌制备

□80%〜90%汇合的MEFs细胞，75cm2培养瓶（或225cm2)

□MEFM(见2.2.3节）

□胰蛋白酶，0.25%，溶解于GIBCO溶液A(参见2.9节）

□PBSA

□明胶，0.1%

□丝裂霉素C(MMC),50ug/ml,溶解于DMEM(过滤除菌）

□多孔培养板，4孔：通常每75cm2培养瓶的MEFs细胞需要1〜4个培养板

□吸管

□离心管，15ml

步骤

(a)用MEFM以1:10稀释MMC，从50Mg/ml稀释至5ug/ml。

(b)在4孔培养板的每个孔中加人0.5ml的明胶。

(c)从孵育箱里取出75cm2培养瓶，内有80%汇合生长的p3或p4代的MEFs细胞。

(d)用IOmI的5ug/ml：MMC，在37°C孵育MEFs细胞2h。

注意：因为制备的MEF细胞可能有变化，新的使用者将要确定MMC完全抑制细抱分裂的最佳浓度和孵育时间。

(e)在MMC孵育的期间，把0.1%明胶涂到4孔板，至少在使用前5min涂板。

(f)用MMC处理完之后，用5ml的PBSA洗细胞一次。

(g)加Iml胰蛋白酶，于37℃孵育4min。

(h)轻轻地敲击培养瓶使所有的细胞脱落，并加人等体积的MEFM终止胰蛋白酶反应，转移到15ml的离心管。

(i)在含有MEFs细胞的15ml离心管里加人MEFM培养基使总体积达到6ml，IOOOg离心5min。

(j)吸去上清，用5ml的MEFM重悬MEF细胞沉淀，仔细确认是单细胞悬液。

(k)用血细胞计数板计数细胞。

(l)从4孔板吸掉明胶。

(m)每个孔以7.5X10⁴个接种MEFs细胞，并且每个孔中MEFM的总量达到500ul。MEFs细胞将在6h内贴壁。

(H)把新接种的培养板放到孵育箱里，准备第二天使用。

注意：MEF细胞在失活之后死亡之前，能够作为hES细胞的饲养细胞来使用的时间为7天，理想的情况是把hES细胞传到MEFs细胞失活1〜3天内的培养板上。