2021-08-17【转帖】qPCR常见问题及其分析解决方法

1.无Ct值出现
　　检测荧光信号的步骤有误:一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
　　引物或探针降解:可通过PAGE电泳检测其完整性。
　　模板量不足:对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
　　模板降解:避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
　　2.Ct值出现过晚(Ct>38)
　　扩增效率低:反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
　　PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
　　PCR产物太长:一般采用80-150bp的产物长度。
　　3.标准曲线线性关系不佳
　　加样存在误差:使得标准品不呈梯度。
　　标准品出现降解:应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
　　引物或探针不佳:重新设计更好的引物和探针。
　　模板中存在抑制物，或模板浓度过高
　　4.负对照有信号
　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
　　引物浓度不佳：重庆新桥医院网上预约挂号www.cqxqyy.net适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
　　5.溶解曲线不止一个主峰
　　引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
　　引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
　　镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
　　模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。
　　6.扩增效率低
　　反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
　　反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
　　反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。
　　7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断?
　　判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性
　　如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。
　　8.扩增曲线的异常?比如“S”型曲线?
　　参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)
　　模板的浓度太高或者降解
　　荧光染料的降解