1.注意事项：

1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80–90％致密度。

1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650)，以5~10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。

1.4.冷冻保存之细胞浓度：

1.4.1.normalhumanfibroblast:1~3x106cells/ml1.4.2.hybridoma:1~3x106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些ybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。1.4.3.adherenttumorlines:5~7x106，依细胞种类而异。Aden℃arcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1-3x106cells/ml。1.4.4.othersUSPensions:5~10x106cells/ml,humanlymph℃yte须至少5x106cells/ml

1.5.冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。

1.6.冷冻方法：

1.6.1.传统方法：4℃10分钟--->-20℃30分钟--->-80℃16-18小时（或隔夜）--->液氮槽vaporphase长期储存。1.6.2.程序降温：利用等速降温机以–1～-3℃/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

2.材料

2.1.生长良好之培养细胞

2.2.新鲜培养基

2.3.DMSO(SigmaD-2650)

2.4.无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)

2.5.0.4％w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)

2.6.血球计数盘与盖玻片

2.7.等速降温机(KRYO10SeriesII)

3.步骤：

3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。

3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

3.5.冷冻保存方法1:冷冻管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。

3.6.冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为:program7:HBCELL

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