2021-07-25【求助】关于荧光定量问题

我试着回答一下吧。1. 那个理论依据我不是很清楚，但是一般如果稀释倍数是十的话CT值相差3.3左右。所以你从结果可以大致看出一些所以然。譬如你的稀释制备标准品比较好，应该可以达到基本上3.3的差异。然后线性分析得出的标线是可以用的。但是如果相差比较大，或者比较小，甚至之间的差异参差不齐，就相对无法用了。2. rox是荧光参比，一般只是消除管间的荧光差异。和热循环没有太大关系。3. 一般认为绝对定量不需要内参，而相对定量需要内参，而且标线法相对定量一般只要选择一个标准品就行，个人认为使用内参就行。

怎么没有人回答啊？自己顶一下！谢谢各位了！

问题真多！！！！！！！1。荧光域值的定义确实是你说的3－15个循环荧光强度的标准方差的10倍，但是实际应用中有时是3-12，有时是5-13，还有时是6-10，这跟每次实验的初始模板浓度和本底有关。域值一般软件会自动根据本底计算的，是可以手动调整或改动的，一般在你认为软件给出的域值不能很好的反映复孔的重复性，或者你认为软件给的域值偏高不在刚刚进入指数期的地方等情况下需要手动调整。baseline一般就是去除掉本底信号，一般软件都有多种方法选择，如取背景的平均值扣除，或取最低值或最高值去除等等。2。读板温度就是检测荧光信号的那一步骤的温度。具体在哪一步读板是根据你选择荧光标记的特性有关的，SYBRGreen一般在72延伸后读板；Taqman探针可以再循环的任一步读板，但是变性阶段选择的人比较少；分子信标在退火后读板；LUX在延伸或者退火后读板等等。也可以自己设定一个温度，除非是染料法为了排除引物二聚体，一般没有必要。3。做绝对定量一般标准品最好是和待测片段同样的基因序列，这样能够像你说的保证扩增效率的可比性，比如医院做乙肝丙肝等等都有很好的商业化试剂盒，里面有制备好的标准品。但是你的基因标准品买不到的时候，也可以自己制备，但对操作要求比较高，公司不可能有那么多商业化的产品。相对定量基本没有人买商业化的标准品，都是自己做，除非穷的只剩钱了。4。2-△△CT分析方法在其原理建立时候就是基于同一管中同时扩增内参和目的基因的方法，如果仔细留意一下各大公司的早期定量软件会发现SYBRGreen染料法是不能进行2-△△CT分析的（现在的软件为了迎合市场需要就不说了），这也侧面说明这一方法是基于探针的同管扩增体系的，所以不赞成内参照法的说法是没有根据的。只不过你说的模板差异很大的情况下用2-△△CT分析方法确实是有限制的，内参一般会优先扩增，而这个时候分开两管扩增就可以解决这个问题，所以大家现在不管效率有多大差异，多数都是分开管子作的，但是孔间温度和耗材的对方应的影响自然就带入了误差。这就是智者见智了，选择适合自己的方法。5。熔解曲线一般都是在循环结束后进行。主峰异常增宽需要跑胶看一下是不是有Tm值相近的非特异条带，它们的分子量一般是可以分开的。探针法是得不到熔解曲线的，不多说了。6。这个问题比较长，不知道我理解的对不对？两个峰值只能说差不多，理论上说两个峰值应该是一样的，但是体系的差别，SYBRGreen染料的重分布问题都会导致峰值的漂移，具体问题具体分析把。勉强回答完毕，贻笑方家。