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用于 PCR 的模板 DNA 制备实验一冰冻片
实验方法原理 | |
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实验步骤 | 1.将10μl冰冻切片直接放入含组织裂解液的离心管中。 2.无菌尖头刀片刮下,放入300~900μl组织裂解液中,并加入20mg/ml蛋白酶K(PK)10~15μl,封口膜封口,置55℃3h以上。 3.其间用指轻弹离心管以利裂解。若有沉淀,再加入5~10μl蛋白酶K,直至无沉淀已澄清为止。 4.灭活蛋白酶K裂解液中含有蛋白酶K,需放入沸水中10min以灭活蛋白酶K。 5.沉淀蛋白质按裂解液量的1/3加入蛋白质沉淀液(饱和乙酸钠)并混匀,14500r/mm离心15min。此时,蛋白质沉于管底,DNA溶解于上清液中。 6.析出DNA取上清液并加入等量冷异丙醇,充分混匀,新鲜标本此时可见DNA丝缠绕成团析出。若新鲜标本童太少或固定组织因DNA片段较小,无法用肉眼见到DNA成团析出,需14500r/min再离心10min,一般DNA可见于管底。 7.洗涤溶解DNA倒去上清液,加入适量的75%冷乙醇,以洗掉残存的异丙醇和无机盐等物质,反复洗2遍。将管底含有DNA的离心管倒扣在清洁纸上,以挥发掉残留的乙醇和水。约30min后,在DNA尚不太干时加入适量TE溶解DNA。 |
注意事项 | |
其他 |
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