1)在1个1.5mL的微量离心管中准备下面物质的混合物：含有每种寡核苷酸440μg的TE缓冲液，总体积为130μL。再加入20μL10×T4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液。88℃温育2min,65℃10min,37℃10min,室温5min。

2)将上述混合物平均分入2个微量离心管中。每管（75μL)加15μL20mmol/LATP(pH7.0)、约5μCi[γ-32P]ATP,10μL10U/μLT4噬菌体多核苷酸激酶（共100U)。37℃温育2h。

加标记的ATP时，不要化冻，仅需用移液器的黄色吸头触碰一下（不要刺入）冻结的[32P]ATP的上层，取少许转入反应管中。

3)每管中加50μL10mol/L乙酸铵及100μL水，65℃加热15min,灭活激酶，冷却至室温。

4)加入750μL100%乙醇，上下颠倒混合。室温下高速离心15min沉淀DNA，弃去上清。

5)各DNA沉淀重悬于225μLTE缓冲液中。

6)加250μL酚/氯仿/异丙醇于各管中。在涡旋混合器上振荡1min。高速离心5min分离两液相，将水相（上层）移至一新管中。

7)加250μL氯仿/异戊醇至水相中。在涡旋混合器上振荡1min,高速离心5min分离两液相，将水相（上层）移至一个新管中。

8)加25μL3mol/L乙酸钠至水相中，振荡混匀。然后加入750μL100%乙醇，上下颠倒混匀，高速离心15min沉淀DNA，弃去上清。

9)用800μL75%乙醇洗涤沉淀，在涡旋混合器上振荡混匀，高速离心5min,弃去上清。

10)在真空旋转蒸发器（如Speedvac)中干燥DNA沉淀。

11)加65μL水及10μL10×接头/激酶缓冲液至每管沉淀中，在涡旋混合器上振荡使DNA溶解。加20μL20mmol/LATP(pH7.0)及5μL6000U/mLT4噬菌体DNA连接酶（30Weiss单位）。在室温下温育>2h,或者15℃过夜。

取决于所用的寡核苷酸，连接的最佳温度可在4〜30℃之间变化。

12)用琼脂糖凝胶电泳监测连接反应，每道加0.5μL连接反应液，并同时带分子质量标记物。用溴化乙锭染色并在紫外灯下观察DNA。

如果未发生连接反应，用25:24:1酚/氯仿/异戊醇抽提DNA1次，用24:1氯仿/异戊醇抽提1次，然后用乙酸钠加乙醇沉淀DNA。重新将DNA溶于225μLTE溶液中，加25μL3mol/L的乙酸钠溶液，再加750μL无水乙醇重新沉淀。用75%乙醇洗涤，在Speedvac中干燥，然后重新进行连接反应。

13)加100μL缓冲液平衡酚至1OOμL连接反应液中。在涡旋混合器上振荡1min,室温下高速离心5min,将水相（上层）移至一新管中。

14)加100μL氯仿/异戊醇至水相中。在涡旋混合器上振荡1min，室温高速离心5min,将水相（上层）移至一新管中。

15)加33μL10mol/L乙酸铵至水相中，在涡旋混合器上振荡混勻。

16)加133μL异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置20min。高速离心15min沉淀DNA，弃去上清。

乙酸铵/异丙醇沉淀可除去残余的ATP，不然后者将影响连接的DNA与溴化氰活化琼脂糖的偶联。

17)225μLTE缓冲液，在涡旋混合器上振荡使沉淀溶解，加25μL3mol/L乙酸钠，在涡旋混合器上振荡混匀。加750μL100%乙醇，上下颠倒混匀，高速离心15min沉淀DNA，弃去上清。

18)用75%乙醇洗涤DNA2次，在真空蒸发器（如Speedvac)中抽干DNA沉淀。

19)将DNA溶解于50μL水中，-20℃保存。

不要将DNA溶于TE缓冲液中，因为TE中的Tris缓冲盐将影响偶联反应。

注意：在进行以下步骤之前，最好是准备好激活和偶联反应所需的所有仪器和试剂，不要让介质变干。

20)将10〜15mL(稳定后的柱床体积）SepharoseCL-2B置于一个60mL粗烧结玻璃漏斗中，用500mL水充分洗涤。

21)将湿的Sepharose介质移至一个25mL量筒中，大约有10mL介质，加水至终体积20mL。将所得的混悬液移至一个150mL的玻璃烧杯中，内有磁力搅棒。将烧杯置于水浴中平衡至15℃,在通风橱内放在磁力搅拌器上，以中慢速搅拌。

22)在通风橱内，称量1.1g溴化氰装入一个25mL的三角锥瓶中，用Parafilm膜或磨砂玻璃盖尽可能地盖住瓶口（稍多于1.1g比稍少为好）。加2mLN，N-二甲基甲酰胺（溴化氰将立即溶解）。在1min内，将溴化氰溶液逐滴加入搅拌中的琼脂糖浆液中。

注意：溴化氰是剧毒及挥发性物质，只能在通风橱内特别小心地使用。小心清除所有的溴化氰废液很重要！在通风橱内，加固体氢氧化钠和甘氨酸（约10〜20mg/mL)以灭活溴化氰，以相似的溶液浸泡污染的器具，让其在通风橱中放过夜再弃去。

23)立即按以下方法加5μLmol/LNaOH：每10s加30μL至搅拌的混合物中，加10min直至1.8mLNaOH加完。

为了方便起见，在反应之前，可以先量好1.8mLNaOH溶液放到一个小管子里，这就避免了换吸头时额外增加的10s。

24)马上加100mL冰冷的水至烧杯中，并将混合物倒入一个60mL粗烧结玻璃漏斗中。

25)仍在通风橱中进行操作，用100mL冰冷的水（<4℃)在漏斗中洗介质4次。接着用100mL冰冷的10mmol/L磷酸钾（pH8.0)洗2次。

26)立即将介质移入1个15mL聚丙烯螺口盖的管子中，加约4mL10mmol/L磷酸钾(pH8.0)直至介质成为均匀的稠浆。

27)立即加入步骤19中的2份50μLDNA溶液。室温下置于转轮上温育过夜(>8h)

28)在通风橱内，将介质移入一个60mL粗烧结玻璃漏斗中，用100mL水各洗2次，再用100mL1mol/LpH8.0的盐酸乙醇胺洗1次。

用盖革氏计数器，比较滤出液及洗过的介质的放射活性水平，从而估计DNA结合到介质上的效率。通常，所有检测到的放射活性都在介质中。

29)在通风橱内，将介质移入一个15mL的带螺口盖的聚丙烯管中，加1mol/L盐酸乙醇胺（pH8.0)至混合物成为平滑的浆状。室温下将该管置于转轮上温育2〜4h。

30)在60mL粗烧结玻璃漏斗中，依次用100mL10mmol/L碟酸钾（pH8.0)、100mL

1mol/L磷酸钾（pH8.0)、100mL1mol/L氯化钾、100mL水及100mL柱储存缓冲液洗介质。

31)将介质保存于4℃(至少可稳定1年，不要冻结）。