材料

溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。

寡核苷酸杂交液
6XSSC(或6XSSPE)
0.05mol/L磷酸钠（pH6.8)
1mmol/LEDTA（pH8.0)
5XDenhardt’s液
100ug/ml变性、断裂的鲑精DNA(Pharmacia公司或按第6章的方案10所述制备)
100mg/ml硫酸右族糖酐（见箄16章信息栏DEAE-右旋糖酐）

寡核苷酸预杂交液
6XSSC(或6XSSPE)
0.05mol/L磷酸钠（pH6.8)
1mmol/LEDTA(pH8.0)
5XDenhandt’s溶液
100ug/ml变性、断裂的鲑精DNA(Pharmacia公司或按第6章的方案10所述制备)

6xSSC或SSPE
在本方案步骤4、5之前，将此液放置于冰上。

TEAC1洗涤液
2.4mol/LTEACl
50mmol/LTris-Cl(pH8.0)
0.2mmol/LEDTA(pH7.6)
1mg/mlSDS
该洗涤液用于长度为50~200个核苷酸的探针。使用前须预温至所需溫度（见步骤6、7)。

TMAC1(5mol/L)或TEACl(3mol/L)
配制5mol/LTMAC1或3mol/LTEAC1水溶液。TMACl用于长度为14~50个核苷酸的探针，而TEACl则用于长度为50~200个核苷酸的探针。这二种试剂均可从Aldrih公司购买。在TMAC1和TEAC1溶液中，加入终浓度约为10%的活性炭，度摔20~30分钟。活性炭沉阵下来后，用Whatman1号通纸过滤季铵盐溶液，并用硝酸纤维素滤膜（0.45um孔径)过滤除菌。测量溶液的折光指数，用下列公式精确计算季铵盐溶液浓度：C=（n-1.331）/0.018,式中C是季铵盐溶液摩尔浓度，n是折光指数。过滤的溶液可在室温下保存于棕色瓶中。

TMAC1洗涤液
3.0mol/LTMAC1
50mmol/LTris-Cl(pH8.0)
0.2mmol/LEDTA(pH7.6)
1mg/mlSDS
该洗涤液用于长度为14-50个核苷酸探针使用，使用前须预温到所需温度（见步骤6、7）。

核酸和寡核苷酸

固定于硝酸纤维素、尼龙滤膜或其他滤膜的目的靶核酸（Southern或Norths印迹、裂解的细菌克隆成噬菌体噬斑的滤膜）

探针

放射性标记的寡核苷酸探针
按方案2或方案7所述制备探针。我们推荐使用磷酸化探针，杂交前按方案4所述用CPB沉淀法纯化探针。这种纯化方法可以除去未掺入的[γ-³²P]ATP,从而减少放射性自显影时易与阳性杂文信号混淆的强放射性斑点（胡椒粉斑点）的数量。

专用设备

杂交装置（请见步骤1)

振荡培养器、水浴或杂交装置预温至37°C(步骤1和步骤3)，洗涤时调至适当的洗涤温度（步骤7)。

方法

1.滤器或膜在寡核苷酸预杂交液中37°C下预杂交4~16h。
圆形滤膜的预杂交、杂交与洗涤最好在SearsSeal-A-Meal袋或带有密封盖的塑科盒中进行，Southern与Northern杂交膜可在有密封盖的玻璃管中进行。

2.去预杂交液，置换成含180pmol/L的放射性标记的寡核苷酸探针的杂交液。
当数种寡核苷酸同时杂交时，每一种探针的浓度都应在180pmol/L,放射性标记探针的比活度应在5X10⁵至1.5X10⁶cpm/pmol之间。

3.滤膜在37°C下温育反应12~16h。

4.将放射性的杂交液弃至适当的容器内，在4°C下用预冷的6XSSC或6XSSPE洗涤滤膜三次，以洗去大部分硫酸右旋糖酐。

5.在4°C下用预冷的6XSSC或6XSSPE洗涤滤膜两次，共30min。

6.在37°C下用TMAC1或TEAC1液洗涤滤膜二次。
此步骤的目的是用季铵盐溶液置换SSC或SSPE,只有认真操作方可见季铵盐溶液的优越性。

7.在低于图10-2指示的T_m值2~4°C的温度下，用TMAC1或TEAC1洗涤液洗涤滤膜二次，每次20min。
杂交体在含TEAC1的缓冲液中的T_m值比在含TMACl的缓冲液中低33°C确保缓冲液中预温至所需溫度，且温度波动小于±1°C。

8.从洗涤液中取出滤膜，室温下吸干液体，按附录9所述进行放射自显影。