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实验材料	T4DNA连接酶感受态细胞
试剂、试剂盒	Taq聚合酶PCR缓冲液溴化乙锭（EB)溶液过硫酸铵（APS)水溶液
仪器、耗材	琼脂糖凝胶
实验步骤	3.1克隆 NExT混编过程中，使用包含限制性酶切位点的混编引物的配对位点应设置在紧挨着目标基因的两侧，理想的退火温度为60°C左右。通过4加2法则估算引物的退火温度：每个G碱基和C碱基为4°C，A碱基和T碱基为2°C。 我们在NEXT混编过程中使用的基因包括：含657个碱基的野生型CAT基因(CATwt；SwissProt编号：P00483；蛋白质数据库（PDB)编号：1NOC：B)，编码N端10个残基截短的突变体，C端9个碱基截短和N端、C端双截短CAT突变体(CAT_Nd10，CAT_Cd9和CAT_Nd10_Cd9)以及C端26个碱基截短突变体(CAT_Cd26)。这些基因和全部的混编基因都克隆到质粒载体PLiSC-SAFH1上[7]，使用Xbal和HindIII双酶切位点替换原始质粒的部分片段。多样性的产生则通过易错PCR和尿苷酸交换PCR(见10.3.2节）。扩增野生型和N端截短的基因使用Pr-Nshuffle (5"-ATTTCTAGATAACGAGGGCAA-3")和Pr-C-shuffle(5’-ACTTCACAGGTCAAGCTTTC-3"）混编引物；而对于扩增C端截短和双截短突变体的基因则使用Pr-N-shuffle和Pr-Cdx-shuffle(5’-CTTCACAGGTCAAGCTTATCA-3’）引物。通过常规方法将这些质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中[8]。 3.2尿苷酸交换PCR 选择尿苷酸作为交换核苷酸，因为许多种DNA聚合酶都可将dUTP引入基因序列[9]。尿苷酸交换PCR在扩增目标基因库的同时，也引入了交换核苷酸，尿苷酸。通过改变dUTP:dTTP的比率可获得理想的DNA断裂效果。这一步骤的实现即可通过分析不同U:T比率的实验，详见10.3.4节，也可使用我们为此目的开发的程序（见10.3.9节）。使用高达50%比率的dUTP并不影响PCR产物的得率。只有在完全使用dUTP的情况下，PCR产物的产量大约为其他反应的1/4(图10.1A)。 (1)为精确加样量，将100mmol/L核苷酸储液用水稀释到dATP、dGTP和 dCTP的终浓度为10mmol/L，dUTP和dTTP终浓度1mmol/L。 (2)尿苷酸交换PCR混合液包括：50ng模板（对含4340个碱基的质粒为0.017pmol)，引物各 25pmol，dATP、dGTP和dCTP各0.4mmol/L，0.4mmol/LdUTP:dTTP不同比率的混合物，5UTagDNA聚合酶，5μl10XPCR缓冲液。用水加至终体积50μl(见注1和注2)。 (3)温度循环程序为94°C预变性1min；92°C变性30s，62°C退火20s，72°C延伸2min，共计25个循环；最后72°C再延伸4min。其中将延伸时间延长至2min是因为测试表明这样可以显著的提高产量（数据略去）。根据PCR的不同产量，需同时做4个或更多的50μl反应体系以获得足够的产物（胶回收后应最好约为7μgDNA；见注3)。 (4)将得到的PCR产物合并，并通过1%的琼脂糖凝胶电泳分离纯化（见注4)。如果量足够多的话，在日光下即可从胶上看到浅红色的条带。将条带切割下来后加到一两个胶回收试剂盒的离心柱中，用50μl洗脱缓冲液洗脱。 (5)使用波长范围220~350nm的分光光度计检测260nm的基线校准吸光值，测定PCR回收产物的浓度。我们通常以1:30稀释后在140μl的比色杯中测量。NExTDNA混编产物最理想的得率为7μgDNA。更低的得率可能也行，但足够量的DNA可确保下一步的基因重组顺利进行（见10.3.7)。将所有理想的DNA都用于下步反应。 在这项研究中，我们均使用尿苷酸作为交换核苷酸，然而此项技术也同样适用于其他类似物的引入。例如，8-氧化鸟嘌呤（8-oxoguanine)可被8-氧化鸟嘌呤DNA糖基化酶FPG(foramidopyrimidine-DNAglycosylate)切除[10]。该减基可用于AT富集区，那里UDG酶频繁的切割DNA，也可用于缺少胸腺嘧啶的GC富集区。因此，将多种交换核苷酸结合在一起使用可以产生所需大小的片段，用于下一步的再组装。另外，在PCR引物中引入交换核苷酸应确保基因库中的这些区域同样被混编。 3.3酶解反应和化学切割 将尿苷酸交换PCR纯化后的产物进行UDG酶解反应，在交换核苷酸位置切割DNA。该酶对双链和单链DNA均有效，通过对双脱氧尿苷C1"位点的亲核攻击引发水解反应，高特异的去除尿嘧啶基团[12]。哌啶用于经UDG酶切割去除尿嘧啶后的骨架部分[13]。通过高分辨率尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析上述切割反应的结果，其中dUTP的比率从100%到0%不等（图10.1B)，进而再用图像分析软件定量（图10.1C)。对于很小的片段，可通过引入放射性标记来更好地观测（见注2)。 (1)UDG酶解反应体系包括45μlPCR纯化产物（含约7μgDNA，见10.3.2节步骤4)，6μl10XUDG反应缓冲液，2U大肠杆菌UDG酶。加水至60μl，37°C消化1h(见注6)。 (2)使用哌啶切割DNA反应体系包括终浓度为10%(m/V)的哌啶（60μl体系中加6.7μl哌啶储液），在有加热盖子的热循环仪中90°C反应30min(见注7)。 作为采用相对温和的反应条件的尝试，用其他的一些内切核酸酶替代哌啶切割骨架DNA[11]，如内切核酸酶IV[14]，核酸外切酶Ⅲ[15]，或T4-内切核酸酶V[16]。我们检测了最后一种但否定了其使用。T4内切核酸酶V切割UDG作用后的DNA结果得到的是不完全断裂，这从产物的大小分布可见（图10.2A)。更麻烦的是这一反应必将引起高错误率的出现。应用UDG和T4内切核酸酶V切割CAT野生型基因，胶回收后进行重组装，送其中的6个克隆共计3930bp去测序，结果突变率为1.75%。对于这一结果我们给出了两个原因。首先，T4内切核酸酶V是通过其裂解酶活性切割DNA骨架，其间催化了一个β消除反应，留下了3"端不饱和的醛基（4-羟基-2-戊醛）连在磷酸基团上[11，17]。进一步生成游离磷酸基的化学反应并未完成，如此产生的片段不利于聚合酶的起始。其次，通过片段比较发现，不是所有引入尿苷酸位点的骨架都完成了切割。但这些位置的尿嘧啶都被切掉了，这种碱基缺失的模板会造成错误核苷酸的引入。Miyazaki[18]建议使用大肠杆菌内切核酸酶V，但从提供的数据可见，切割的效率更低，即使延长切割时间（12h)并提高dUTP的比率（75%)仍不能获得短的片段。虽然可以设计进一步的实验解决这些问题，但因哌啶的切割即好又划算，就没有必要再做尝试。 作为哌啶的化学替代品，我们检测了氢氧化钠的效果。将哌啶储液替换为0.5mol/L氢氧化钠溶液，加至DNA体积的10% (V/V)，90°C反应30min。使用哌啶和氢氧化钠切割相同的尿苷酸交换PCR产物，比较二者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后EB染色的结果。通过图像分析软件，得到的断裂片段的强度分布基本一致。平行进行的重组装反应也得到了相似的结果。这些都证明了哌啶引发的主要反应是碱催化的β消除反应，将两个余下的磷酸基从DNA的糖基上去除下来。因此，如果非常重视安全因素，可用氢氧化钠替代哌啶。然而我们未测序分析氢氧化钠切割片段重组装后的产物是否产生突变。原则上，哌啶更适合引发糖基上的亲核攻击，切割的效果也更为彻底。  3.4尿素变性聚丙酰胺凝胶电泳 使用尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析断裂片段的大小分布并纯化特殊大小范围的片段（见10.3.5)。此步为备选步骤，仅对要求严格控制的断裂反应推荐使用。 (1)凝胶包含6.7mol/L尿素，11%~12%的聚丙烯酰胺和1XTBE缓冲液[8]。分析胶的大小为10cmX8cmX1mm，制备胶的大小为10cmX8cmX2mm(见10.3.5.2)。因尿素降解会影响电泳效果，故要求所有的凝胶都新鲜制备。我们通常使用31.5g尿素，29.2ml包含30%聚丙烯酰胺，0.8%甲叉双丙烯酰胺（37.5:1)的凝胶储液，17.1ml水，7.5ml10XTBE缓冲液，500μl10%APS水溶液和50μlTEMED；这些足够在一个制胶器中同时制备9块分析胶（见注8)。 (2)电泳在56°C进行。我们使用HoeferMighty小型基础电泳槽（Amersham)，配接温度控制水浴锅。 (3)在1XTBE缓冲液中将凝胶预电泳10min，电压100V。 (4)将断裂DNA浓缩至7μl，加至speed-vac真空离心挥发哌啶，加25μl去离子甲酰胺，在PCR仪中80°C加热3min(见注9)。再加入3μl60%的蔗糖溶液和7μl水帮助上样（见注10)。最终上样量为15~20μl (约含3μgDNA)。 (5)寡核苷酸混合液和100bpDNA标尺可作为分子质量标准（见注11)。至少一个标尺使用带染料的上样缓冲液。 (6)上样后170V进行电泳，至标尺中的溴酚蓝距边缘还有0.5cm时结束（见注12)。 (7)在30ml1μg/ml的EB溶液（1:5000稀释）中染色5min，紫外灯下观察（见注13)。 分析型凝胶电泳结果表明，断裂产生片段的大小分布具有固定的峰值，由dUTP所占的比率决定。如图10.1B所示，多个长度分布带很容易得到，包括很小的和大的片段，分别适用于短的基因和长基因簇的混编。这样的测试只用于最初确定合适的dUTP比率以获得目标的片段大小分布。最后确定测试库中dUTP使用的最佳比率为33.3%，且结果的重复性很好。因此，在接下来的定向进化实验中，此步分析电泳可以省略。 3.5片段纯化 经酶解和化学裂解得到的基因片段（见10.3.3)即可通过硅胶树脂直接从切割反应液中纯化（见10.3.5.1)，也可通过制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化（见10.3.5.2)。 最初我们认为如想得到特定大小的片段必须通过凝胶电泳来纯化，以确保在重组装反应中没有较长片段甚或全长片段的参杂，以免影响碰撞概率。而实际上，如不经多轮的重组装反应，就无法从纯化的片段中直接扩增出全长产物，这表明切割反应进行的十分彻底（见10.3.7)。因此，只有对片段大小范围有十分严格的要求时才有必要使用凝胶电泳纯化。 3.5.1哌啶切割后直接纯化 (1)最简便的片段纯化方法就是使用QiaexII试剂盒（Qiagen)从哌啶切割后的反应液中直接纯化（见10.3.3)。依据该试剂盒指南进行操作（见注14)，加入结合缓冲液后中和（约20μl3mol/L乙酸缓冲液）。 (2)清洗两次后，分两步加入25μl洗脱缓冲液洗脱。将两次洗脱液混合。 (3)离心两次，每次换一个干净的离心管（见注15)。 3.5.2尿素变性聚丙烯酰胺凝肢电泳纯化 注意此步为可选步骤。尝试了两种方法从凝胶中回收片段。一种是经典的水提取后乙酸/镁离子沉淀法，另一种是使用Qiagen公司的QiaexII试剂盒。但通过染色检测提取完基因后的凝胶，发现两者都存在提取不完全的问题。  (1)经制备型尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后（见10.3.4，步骤1)，在低强度紫外灯照射下将目标大小的条带切割下来（图10.2B)。放入离心管中充分捣碎后加入提取缓冲液（QiaexII提取，步骤2)或1ml水（水提取，步骤3)，放入热混合器（Eppendorf)中以37°C，1000r/min过夜孵育。 (2)如果使用QiaexII提取缓冲液提取，见10.3.5.1节。 (3)如使用水提取，加1/10体积的乙酸缓冲液，1/100体积的氯化镁和1体积的异丙醇沉淀DNA；-20°C反应1h；4°C20000g离心15min；将沉淀重悬在50μl90%乙醇中，放入热混合器中37°C，1000r/min反应1h；-20°C放置1h；4°C20000g离心15mm；将沉淀在空气中晾干后，加入30μl加入洗脱缓冲液，37°C，1000r/min孵育1h。 为得到胶提取步骤的交叉率，我们设计了3个母本克隆（CAT_Nd10突变体）的混编检测实验。其中两个克隆在 100bp范围内包含1个特异的突变，另一个在100bp范围内包含2个特异突变。混编并经Tag酶扩增后挑选8个克隆测序，结果表明其中的6个克隆在100bp范围内有一个交叉。这与直接快速纯化得到的交叉率可比（见10.3.5.1和10.3.8)。实验共测序了3851个碱基，发现了12处错误，突变率为0.31%。这样的错误率比快速纯化的错误率高很多，可能是由于UV照射（哪怕是弱的366nm的光源）或是凝胶中的化学修饰引起的。因此我们在最终的NExTDNA混编方法中，去掉了凝胶纯化的步骤，因为额外的工作并未带来益处，反而损失了产量，提高了错误率。 3.6纯化片段的定量 为了分析和比较纯化得到的DNA的产量，我们首先使用SYBRGreenn试剂来定量。因为NExTDNA混编方法的重复率很髙，我们只定量一次即可（见注16)。通常我们都能获得浓度为40~60ng/μl的DNA片段。 (1)取2μl纯化的DNA片段（见10.3.4)，加入50μl1:5000稀释的SYBRGreenII溶液染色，此染色液对单链DNA非常敏感（见注17)。 (2)在暗箱中反应5min后检测荧光信号（我们使用96孔的PerkinElmer LS50B荧光粉光光度计；见注18)。染料的激发波长是480nm，可在515nm检测发射值。 (3)使用片段大小范围内的标准寡核苷酸，稀释不同的倍数绘制浓度标准曲线，标定片段所含DNA的浓度。 3.7基因重组装和扩增 通过内部引物延伸反应从纯化的基因片段重组得到全长基因（见10.3.5)，其间不断提高退火温度并最好使用具有校正功能的DNA聚合酶，如Vent (图10.3)。在内部引物延伸PCR过程中，片段之间可相互作为引物，因此每个循环反应后都会加长，直到最终得到全长基因。最后，通过常规PCR反应，加入两个末端引物对组装反应的产物进行扩增，构建克隆送测序。在方法建立过程中，通过琼脂糖凝胶电泳不断检测重组装反应结果（图10.3)。重组装反应在进行若干轮后停止，所得产物在此基础上进行PCR扩增。最后一步反应的基本原理与其他的基因组装进程相同，但有很重要的改变。尽管经历了剧烈的化学切割条件，使用了高保真DNA聚合酶的组装反应仍很高效。 (1)取出约2μg的纯化DNA片段（见10.3.5)进行重组装。事实上如使用Vent聚合酶，少于1μg的DNA片段都够用。通常我们都使用20~25μl的片段溶液，无须检测浓度。 (2)在DNA片段中加入4μl(见注19)10mmol/L的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物（终浓度800μmol/L)，以及4UVentDNA聚合酶（NEB)，1~4μl25mmol/L的硫酸镁，5μl的10X反应缓冲液，加水定溶至50μl。 (3)循环反应为94°C3min；92°C变性30s，30°C退火60s，每轮增加1°C(冷却率1°C/s)，72°C延伸1min，每轮多加4s，共进36个循环；最终72°C再延伸3min。 (4)取重组装产物10μl(见注20)使用基因的合适引物（25pmol引物，0.2mmo/LdNTP，25个循环，40s的延伸时间），进行常规PCR反应。 (5)使用适当的限制性酶切位点将扩增的基因克隆到载体上。 据我们所知，大多数已发表的片段重组装过程都使用Taq酶。VentDNA聚合酶的3"→5"校对核酸外切酶活性是基于其仅在3"端移除合成链上错配的核苷酸，直到聚合反应可以从退火的末端开始。这意味着核苷酸链上的点突变，即便是紧邻3" 端的位置，都不会有问题[19]。为了比较这两种聚合酶的作用，分别使用Tag和Vent酶平行进行两组重组装实验，均使用相同的片段库作为起始。适量的重组装产物作为扩增PCR的模板，当使用Taq酶时，产物经琼脂糖凝胶电泳只有一条带，然后通过图像分析定量。结果，使用Vent酶的得到DNA产量为Taq酶的35倍。有意思的是，将使用Tag酶得到的6988个碱基测序，发现只有5个额外的突变（0.075%)。因此，在现有序列的统计误差内，使用Tag和Vent酶进行NExTDNA混编产生的错误率基本是相同的（见10.3.8)。关于两者产量的显著差别，可用校正酶的性质来解释。以Vent酶为例，该酶具有链置换活性[20]，这可能会帮助许多杂交反应的进行，另外Vent酶在95°C的半衰期约为8h，相对于Tag酶的1.6h[20]，更适合长时间的重组装反应。另外，Taq酶习惯在3"端多加额外的dATP[21]，这也是妨碍重组装反应进行的可能原因。除了上述因素，还发现Tag酶虽然适合片段的重组装反应，但其重组装的产物作为下一步扩增反应的模板，很难使用具有校正功能的DNA聚合酶进行扩增。 3.8交叉率、片段的平均长度及突变率分析 将上面描述的NExTDNA混编技术应用在600bp长的CAT基因的定向进化研究中，其中N端和C端分别截短10个和9个氨基酸残基（CAT_Nd10_Cd9)。实验中，挑选12~383碱基间具有不同突变模式的5个克隆与一个用于回交的截短野生型克隆相混合作为固定库，进行33.3%尿苷酸交换PCR来混编。从溶液中直接纯化片段（见10.3.5.1)，再经Vent聚合酶进行重组装反应（见10.3.7节）。在没有抗性选择压力的对照平板中挑选8个混编克隆进行测序（图10.4A)。这些克隆独特的突变模式显示所有被检测的克隆都是从2(如克隆1)~4个（如克隆4)母本克隆演化来的。在所涉及的372bp的片段中，每93~186bp就有一个交叉，平均片段长度为114bp。 通过测序结果计算突变率。在所测的4425个碱基中，发现了4个突变（一个A变为G，一个T变为C，1bp的插入和1bp的缺失），计算突变率为0.09%。这比之前报道的DNA酶混编的错误率0.7%要低得多。如10.3.7节中所述，并不是只有Vent聚合酶才能达到如此低的突变率。因为我们得到的片段大小分布和交叉率均与DNA酶混编的实验结果相当，因此分析前面报道的高错误率可能是由DNA酶解及凝胶观测时的紫外损伤引起的，而与片段大小和聚合酶种类无关。低突变率对长片段DNA的混编尤为重要，因为我们要尽可能地避免将功能异常的或不需要的分子引入基因库中。 进一步的实验中，挑选4个截短CAT基因（CAT_Cd26)母本进行了上述相同的混编实验，它们均包含一个突变，分布在9~575碱基，最终挑选5个克隆测序（图10.4B)。可检测的片段平均长度为86bp，其中包括许多短的片段。在“对照5”克隆中，突变位置分别相隔仅6个碱基（324和330位置），12个碱基（364和376位置）及11个碱基（404和415位置）的突变体都被分开。这次实验得到片段的平均长度比之前的实验要小，这是因为更多的突变利于片段长度的检测。至于许多短片段的获得可能原因有两点：使用的QiaexII试剂盒可高效的回收短片段DNA，或者基因扩增时的交叉是一个复杂的过程，包含如PCR基础上的链交换。 3.9NEXT片段断裂—预测程序 因为dUTP的掺入及产生的片段断裂都基于可推导的原则，我们开发了名为NExTProg的计算程序。该程序可预测双链DNA的NExT断裂模式，使得研究人员不需要实验就可设计合适的dUTP:dTTP比率。该程序通过读入DNA序列文件和dUTP:dTTP比值，就可算出所有可能的片段、它们出现的可能性及相对分布。给定DNA的互补链由程序自动生成并加入计算。计算后的结果以柱型统计图表形式显示，所有数据都可以列表形式输出以备使用（图10.5A )。当需要设定片段大小的上下限时（如凝胶纯化所需），程序可计算材料损失的可能性并调整每个片段的相对分布值。 3.9.1数学原理 (1)设定给定DNA序列中的一个胸腺嘧啶被尿嘧啶替代的概率为p。 (2)当两个胸腺嘧啶都被尿嘧啶替代时，就生成两者之间的片段，其概率为pXp。 (3)只有当上述两个胸腺嘧啶间的n个胸腺嘧啶都不被替代时，片段才能存在，得到的概率为pXp X (1-p）n。 (4)对于包含1个或2个DNA末端的片段，pXp概率中的1个或2个p设为1(见注21)。 (5)为比较断裂结果，我们定义片段概率为除以所有值的和。 我们的计算方法与先前的计算都不同[23]，因为我们考虑到片段的两个末端都需要产生，但不考虑诸如序列偏倚性和不确定的酶解条件等问题，这些会严重阻碍对DNA酶酶解的计算。 对于包含x个尿苷酸的基因，最多可产生可能片段[根据高斯定理，当x为奇数时，等于（x+1) X（x+2) /2；见注22]。因此，对于一个典型的包含250个胸腺嘧啶和240个腺嘌呤（在互补链中也计算为胸腺嘧啶）1000bp长的基因，很快程序计算产生31626+29161 =60787个片段，包括它们的概率和序列。 因为大多数用户可能都对结果概貌感兴趣，该程序将所有具有相同大小的片段汇集在一起，将它们的概率加和，给出占所有概率加和的百分比对长度的分布，在程序中以“％mol”表示。为了将电泳条带可视化，通过某一片段的概率乘以其长度计算“mass”分布。这些值被均一化，代表碱基比率，定义为“mass”，如在碱基对中固定长度，程序中显示为“％mass”。片段序列的输出文件按出现可能性由大到小列出了所有的片段。同样的序列只列出一次，概率为它们的加和。 3.9.2程序的校准及与实验结果的对比 在比较测量和计算的结果之前，有一个非常重要的值要考虑：就是交换PCR时聚合酶掺入尿苷酸对胸苷酸的比率。这个值可能不仅取决于dUTP:dTTP的值，也取决于使用的聚合酶类型、核苷酸的绝对浓度以及使用的缓冲液。因此当使用程序时，需要设定该值。尿苷酸的掺入量可用下列方法测量：直接的方法是通过放射性标记的dUTP，计算PCR产物的放射能；间接的方法是定量分析断裂图谱。我们选择后者，因为它同时提供了与我们的软件相似的基本原则。但需要注意这种对资料的双重利用只有在断裂完全的情况下才有效。 为定量分析裂解实验，我们使用常用的条件（标准Tag聚合酶[24]，200μmol/LdNTPs)。 (1)在尿苷酸交换PCR反应中（见10.3.2，见注2)，使用32P-dCTP标记的DNA。 (2)进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（见10.3.4)。 (3)通过成像仪对凝胶进行放射能成像（见注23)。这避免了因小片段的低效染色造成的信号变形。 (4)将每条带都通过图像分析软件，如QuantityOne(BioRad)或NIHImage/ScionImage/imagej)生成线密度曲线。 (5)从线密度曲线中计算出片段和放射标记的分子质量标准的相对迁移值。 (6)将代表标记物相对距离和长度的可变参数a和b代入方程：相对距离=a XIn(碱基对长度）+b。 (7)用上述公式将片段的相对距离值换算为核苷酸长度。 (8)通过结合整数的核苷酸长度值和将相应的强度信号平均化，将强度信号/连续长度分布转换为强度信号/整数（只列出分散的寡核苷酸长度）。 (9)通过将每个单独的强度除以强度总和，将分布均一化。 上述变性胶的放射能成像图见图10.5B。强度均一化后表示为“％mass”（见图10.50。将这一实验与程序计算结果相比较确定的尿苷酸对胸苷酸的相对掺入值。程序计算中，设置的掺入值为0.2~0.3，按0.01增长。当设置值为0.26时，实验和计算结果最为吻合，其中根据测量和均方根分析预测的片段大小范围为10~150个碱基，而计算得到的可靠片段长度为4~200个碱基（图10.50。当使用分子质量标准的范围时（20~100个碱基），因子最佳的设置值为0.25。很显然这些图谱重叠得很好，并且电泳条带中的峰和点都可以很好地解释（图10.5B、图10.50。重要的是，y轴的值落在了不需进一步调整的位置。我们确信尿苷酸的掺入率是确定的，并且没有不完全断裂造成的影响，因为实验和计算得到的结果几乎一模一样，并且尝试了许多实验条件检测断裂情况。使用33.3%U断裂的放射活性测量值与计算值也吻合得很好。但使用25%U断裂的放射活性检测结果中产生了相当量的大于100bp标准的片段，并且出现了一些因标尺问题引起的偏离。然而同样使用掺入率0.26，与使用EB染色后的断裂结果相比较，考虑到凝胶染色的长度依赖性，结果十分吻合（图10.5D)，其中EB染色因有合适的分子质量标准，对于较长片段更为准确。因为针对放射活性检测和EB染色的尿苷酸掺入PCR分别使用了不同的缓冲液（见10.2.2)，多种PCR增强剂，如硫酸铵、吐温-20或Triton X-100的加入对dUTP对dTTP的掺入率并没有显著的影响。 展开