材料

溶液和缓冲液
稀释贮存液至适当浓度。

氯仿
任选，见步驟7。

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

乙醇

酚：氯仿
任选，见步骤7。

乙酸钠（3mol/L,pH5.2）
任选，见步驟7。

TE(pH7.6)

Tris-Cl(1mol/LpH8.0)
任选，见步骤7。

Tris-SDS层析缓冲液
10mmol/LTris-Cl(pH8.0)
0.1%(m/V)SDS

核酸和寡核苷酸

放射性标记的寡核苷酸

纯化的原料为方案2(步驟3或步骤5)的反应混合液，T4噬菌体多核苷酸激酶已在68°C灭活。

专用设备

凝胶过滤树脂（Bio-GelP-60fine-grade或SephadexG-15)
Bio-GelP-60(精细级）可以从Bio-Rad公司购买，大多数化学试剂供应商可提供SephadexG-15(如Sigma公司）。Bio-GelP-60是預胀后产品，而SephadexG-15则必须在使用前膨胀及平衡。

破璃棉
用铝箔包裹少置的玻璃棉，按包裹物的灭菌程序在15psi(1.05kg/cm2)下高压灭菌微量离心管（1.5ml)放于管架或收集器用于收集放射性标记的寡核苷酸层析洗脱液。

巴斯德吸管

附加试剂

步骤6需要的试剂列于第13章的方案7。

方法

1.有放射性标记的寡核苷酸的微量离心管中加入30ul20mmol/LEDTA(pH8.0)溶液。在准备大小排阻树脂时，将样品保存于0°C。
为方便起见，本方案以Bio-GelP-60树脂为例，亦可同样有效地应用于SepbadexG-15。

2.用消毒巴斯德管制备Bio-GelP-60层析柱。

a.用10倍体积的Tris-SDS层析缓冲液平衡厂家提供的Bio-GelP-60树脂。
如果有离心蒸发器（SavantSpeedVac或类似设备）,可以用0.1%的碳酸氢铵溶液装Bio-GelP-60层析柱及冲洗，收集的含放射性标记的寡核苷酸组分可以用离心蒸发器干燥（步骤6),而不须用有机溶剂抽提或乙醇沉淀寡核苷酸。

b.将一团灭菌后的玻璃棉塞入消毒的巴斯德吸管底部。
玻璃毛细管亦可作为很好的填塞工具。.

c.准备好层析管后，倒入少量Tris-SDS层析缓冲液，检查缓冲液流速（以数秒一滴为宜)。

d.将Bio-GelP-60树脂浆倒入层析管。树脂随重力下沉，缓冲液流出，柱身迅速形成。再加入树脂浆，使玻璃棉塞至吸管顶端附近的缢痕处完全被充填。

e.用3mlTris-SDS层析缓冲液冲洗柱子。
重要勿让层析管流干。必要时用封口膜封住管底。

3.用吸管吸去树脂上端多余的缓冲液，然后迅速将放射性标记的寡核苷酸加到树脂上
(体积100ul或稍小）。

4.样品进入层析树脂后，立即加入100ul缓冲液，待缓冲液进入树脂后，即刻连续补充新的缓冲液，不要让层析柱流干。

5.用手提式微型探测仪检测放射性标记寡核苷酸的流动。待流出液开始出现放射性时,用微量离心管收集两滴液体。
警惕：磷酸化反应常常使用大于100uCi放射性标记的ATP,因此上清中放射性剂量相当可观，应小心、谨慎处理未掺入的放射性标记物、移液器吸头及微量离心管。

6.当放射性液体接近全部流出时，用液闪仪测量各组分的切伦克夫计数（见附录8）。如果快速移动的洗脱峰（放射性标记的寡核苷酸）与移动较慢的未掺入的[γ-³²P]ATP能明显分离，可以合并所有含放射性标记寡核苷酸的组分。如果各峰分离不明显，即取每一组分各约0.5ul，用测定结合于DE-81滤膜放射性（详细方法可参阅第13章的方案7中步骤3)或薄层层析方法分析。再合并不含未掺入放射性[γ-³²P]的放射性标记寡核苷敢组分。

7.如放射性标记的寡核苷酸用于酶促反应，应进行下列步骤。否则，进行步骤8。

a.用等体积酚-氯仿抽提合并的标记寡核苷酸组分。

b.用50ul10mml/LTris-Cl(pH8.0)反向抽提有机相，并合并两次的水相。

c.用等体积氯仿抽提合并的水相。

d.加入0.1体积3mol/L乙酸钠（pH5.2),简单混旋，再加3倍体积的乙醇，0°C放置30min。4°C下以最大转速离心20min用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇（放射性含量很低)。

8.在离心管中加入500ul80%的乙醇，稍加振荡，再以最大转速离心5min。

9.用装有一次性吸头的微量移液器吸去管中的乙醇。将离心管打开管口，放置在试验台聚异丁烯酸树脂有机玻璃防护屏后，直到剩余的乙醇挥发干净。

10.用20ulTE(pH7.6)溶解沉淀的寡核苷酸，于-20°C保存。