一、材料与设备

所有的缓冲液和溶液必须无RNA酶污染。

1.RNP制备和DEAE层析

(1)缓冲液D:20mmol/LHEPES(pH8.0)，100mmol/LKCl，0.2mmol/LEDTA。20%甘油，高压灭菌。在使用前加DTT至1mmol/L。加苯甲磺酰氟（PMSF）至0.1mmol/L。

(2)DEAE-SepharoseCL-6B(Pharmacia公司、Piscaraway，NJ，USA)。

(3)缓冲液D₁₀₀：20mmol/LHEPES(pH8.0)，100mmol/LKCl，10mmol/LMgCl₂，20%甘油，高压灭菌。在使用前加DTT至1mmol/L，加苯平横酰氟（PMSF)至0.1mmol/L。

(4)缓冲液D₁₀₀:同缓冲液D₁₀₀，但是KCl浓度为400mmol/L。

2.RNA制备

(1)蛋白酶K(PK):用dH2O配制成10mg/ml储存液，储存在-20°C。

(2)2XPK缓冲液：20mmol/LTris-HCl(pH7.5)，300mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA，2%(m/V)SDS。

(3)无RNase的DNaseⅠ(10U/μl，BoehringerMannheim公司，Indianapolis，IN，USA)。

(4)10XDNaseⅠ缓冲液：100mmol/LTris-HCl（pH7.5)，50mmol/LMgCl₂。

(5)酚：氯仿溶液：等体积酚和氯仿混合，先用100mmol/LTris-HCl（pH7.5)进行平衡，再用TE[10mmol/LTris-HCl(pH7.5)，1mmol/LEDTA]缓冲液平衡。

(6)3mol/L乙酸钠（pH7.0)，高压灭菌。

3.寡核苷酸靶向的RNaseH保护试验

(1)与靶向RNA序列互补的DNA序列，长12~20nt。

(2)RNasin(40U/μl，Promega公司，MADIson，WI，USA)。

(3)E.coliRNaseH（1U/μl，BochringerMannheim公司）。

4.Northern印迹和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

(1)TBE缓冲液：90mmol/L的Tris-硼酸盐，2mmol/LEDTA。

(2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺-尿素溶液：用TBE缓冲液制备含0%和20%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为20：1)的溶液，含50%尿素，过滤，室温保存在棕色的瓶子中。

(3)用dH₂O配制10%过硫酸铵溶液。

(4)N，N，N，N，四甲基乙二胺（TEMED）。

(5)尿素凝胶点样缓冲液：50%尿素（m/V），1XTBE缓冲液，0.05%溴酚蓝（m/V），0.05%（m/V）的二甲苯青。

(6)转移缓冲液：10mmol/LTris-乙酸盐（pH7.8)，5mmol/LNaAc，0.5mmol/LEDTA。

(7)电转移设备（Biorad公司、Hercules、CA、USA)。

(8)尼龙膜：采用不带电荷（Amersham公司，LittleChalfont，Buckinghamshire，UK）或者带正电荷的尼龙膜（BoehringerMannheim公司）能够获得好的结果。

(9)3MM层析纸（Whatman公司、Clifton、NJ、USA)。

(10)20XSSPE缓冲液：3.6mol/LNaCl，200mmol/LNa₂HPO₄（pH7.7），2mmol/LEDTA。

(11)Denhardts溶液（100X）：2%(m/V）BSA组分V；2%（m/V）Ficoll400；2%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮。

(12)10%SDS(m/V)储存液。

(13)预杂交溶液：5XSSPE缓冲液，5XDenhardts溶液，0.1%SDS，50μg/mltRNA。

(14)³²P标记的寡核苷酸（1ng/μl，1~5X10⁷cpm/μgDNA），使用T4多核苷酸激酶和[λ-³²P]ATP标记5末端。

5.引物延伸

(1)AMV反转录酶（5~10U/μl，Promega公司），包括5X反应缓冲液。

(2)含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP（浓度均为10mmol/L）的核苷酸溶液。

(3)³²P标记DNA寡核苷酸片段。

6.自然状态下RNP的凝胶电泳

(1)琼脂糖。

(2)20%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺为80：1）溶液。

(3)RNP凝胶点样缓冲液：0.3XTBE缓冲液，80%甘油，0.05%(m/V)溴酚蓝（m/V)，0.05%(m/V)的二甲苯青。

(4)1.5mm垫片和小的垂直板凝胶的梳子。

二、试验方法

1.RNP的制备

无论是全细胞、细胞质还是细胞核都可以制备RNP。尽管RNaseH切割试验可以在粗提物中成功的进行，但是这些结果的准确性有待于进一步的验证，因为相同的RNA可以存在于不同的RNP中或者以不同的构象存在，另外在粗提物中进行试验，RNP和RNaseH切割产物的降解也是一个严重的问题。这些潜在问题可以通过DEAE层析纯化RNP在一定程度上避免，DEAE层析可以富集剪接体snRNP，但是这样的处理过程给RNA-蛋白的相互作用增加了额外的条件，比如进行高盐洗脱时许多RNP就被压缩成结构紧密的稳定复合物，从而影响了对它们的分析。

DEAE层析所有步骤必须在4°C进行。

(1)制备一个5ml的DEAE-Sepharose柱，用于经缓冲液D透析的50ml粗提物的分级分离。先用水和乙醇洗柱子，再用少量的缓冲液D₁₀₀洗层析柱，用1:1的DEAE-Sepharose的D₁₀₀悬液装柱，这步最好用蠕动泵进行，用5ml缓冲液D₁₀₀洗层析柱。

(2)调节粗提物中MgCl₂浓度至10mmol/L。将粗提物缓慢加入到层析柱中，注意不能让层析柱流干，用50ml缓冲液D₁₀₀洗层析柱。

(3)换成缓冲液D₁₀₀洗脱RNP，收集洗脱液15管，每管1ml。

(4)通过分析组分中snRNP的峰来确定蛋白质峰（通常在组分5和10之间），收集合适部分，液氮进行冷冻，储存于-70℃。

2.RNA的制备

要确定RNaseH保护试验中RNA的保护是否是由于蛋白或RNA构象阻止酶接近造成的，必须用相同离子强度下去除了蛋白后RNA的RNaseH切割试验作对照。进行抽提物反应和对照反应的RNA数量应该相等，下面步骤的量可以根据要求增加或者减少。

(1)将100μl抽提物或者RNP制备物与100μl2X蛋白酶K缓冲液（蛋白丰富的抽提物此时变得轻微浑浊）混合，加蛋白酶K至终浓度为0.2mg/ml，在50°C条件孵育反应液1h。

(2)酚：氯仿抽提：加入等体积的酚：氯仿，振荡10s，16000g离心2min，将上清转移到新的离心管中，如果在两液面间有白色蛋白层，重复抽提一次。

(3)用3倍体积无水乙醇沉淀RNA，70%乙醇洗涤，干燥沉淀。

(4)用89μl水溶解沉淀，加10μlDNaseⅠ缓冲液和1μlDNaseⅠ，37℃孵育30min。

(5)用等体积酚：氯仿抽提，加1/10体积3mol/LNaAc（pH7.0）和3倍体积的无水乙醇进行沉淀，用70%乙醇洗涤，干燥沉淀。

(6)用100μl水溶解RNA沉淀，储存于-20℃。

2.寡核苷酸靶向的RNaseH保护试验

了解RNA的二级结构对选择DNA寡核苷酸杂交链靶向序列很重要，靶向序列多位于单链区或者环状区。尽管4个碱基对的退火寡核苷酸作为RNaseH切割的底物已经足够，但是高效特异配对通常需要不少于12个碱基对的寡核苷酸，因此最好对凭经验得到的针对RNA不同序列的DNA寡核苷酸序列进行比较和评价。引物延伸效率可以用来选择或者检测寡核苷酸对特异RNA的直接结合能力。

(1)标准RNase保护试验一般在25μl体系中进行，体系中含有15μl抽提物或者RNP制备物，40mg/mlDNA寡核苷酸，12mmol/LHEPES（pH8.0），60mmol/LKCl，3mmol/LMgCl₂，1mmol/LDTT，20URNasin，1UE.coliRNaseH。对照采用相同量的相同来源的RNA在相同的离子条件下进行。反应液在30℃孵育60min。

(2)RNA片段的分析，加入75μl重蒸水，100μl2XPK缓冲液，4μl蛋白酶K终止反应，如前所述制备RNA[2“RNA的制备”中步骤(1)~(5)]。

(3)如果进行RNP片段的分析，反应液可以直接用于下面的试验。

4.RNaseH切割产物-RNA片段的分析

在进行RNaseH切割以后对RNA片段的分析可以用Northernblot或引物延伸法进行分析。

(1)Northernblot

在RNANorthernblot分析时，探针一般选择DNA寡核苷酸的互补片段，它们可以特异的检测到非常小的RNA片段，因此在下面的操作步骤中，特殊的杂交和洗涤条件是针对寡核苷酸探针设计的。

①变性PAGE凝胶电泳：安装小的垂直凝胶（17cmX18cm）玻璃板，垫片厚度为0.4mm。

②8%凝胶的制备：将10ml20%丙烯酰胺/50%尿素和15ml0%丙烯酰胺/50%尿素储存液混合，然后加入200μl10%APS和20μlTEMED，混匀，立即灌胶。聚合完成以后（最少需要3min），用1XTBE缓冲液在800V预电泳30min。

③RNA沉淀重新溶解在尿素点样缓冲液中，上样前样品在90°C加热1min，短暂离心收集所有反应管底部的样品，取适量上样，用TBE缓冲液于800V进行电泳，直到溴酚蓝到达凝胶底部。

④电转移将RNA从聚丙烯酰胺凝胶转移到尼龙膜上，做一个夹层结构保证凝胶和尼龙膜能够紧密接触，将两个海绵垫和三张3MM滤纸在转移缓冲液中浸泡，同时将凝胶和尼龙膜在转移缓冲液中进行平衡，在一个夹持器中按如下顺序放置各层，海绵垫、两层3MM的滤纸、凝胶、尼龙膜、第二层3MM滤纸、海绵垫，在放置时各个层之间避免出现气泡，放置好后安装到电转移装置上，加入转移缓冲液，在4℃条件下，50V转移2h。

⑤打幵夹层，尼龙膜空气干燥10min，用UV交联仪（312nm）进行RNA和膜的交联，RNA面朝向光源，用最大强度照射膜10min，然后在空气中使膜完全干燥。

⑥用杂交液在37℃进行预杂交，时间不少于2h，然后加入200ng³²P标记的寡核苷酸探针，37℃杂交过夜。

⑦用5XSSPE，0.1%SDS溶液洗涤两次，然后再用2XSSPE，0.1%SDS溶液洗涤两次，每次洗涤要在37℃洗涤15min。

⑧用塑料膜完全包裹湿的尼龙膜，置于暗盒中进行X射线片显影。

(2)引物延伸

①反应：用13.5μldH₂O溶解RNA沉淀，加4μl5X反转录缓冲液和1μl³²P标记寡核苷酸探针（1ng/μl），70℃孵育5min。然后在冰上孵育5min。

②转录反应：在18.5μl的退火反应液中加入1μl10mmol/L的dNTP，0.5μl反转录酶，42°C孵育45min。

③加入2μl3mol/L的NaAc（pH7.0）和60μl无水乙醇沉淀核酸，干燥沉淀，用尿素点样缓冲液溶解沉淀，变性PAGE电泳分离。

④干燥凝胶，X射线片显影。

5.RNaseH切割产物-RNP片段的分析

如果发生了位点特异的切割，那么通过对经RNaseH切割产生的RNP片段的分析可以了解结构域的结构，也就是蛋白的哪个部分与哪一个RNP亚结构域相结合。从不同的RNP和RNA中分离特定的RNP的试验方法包括甘油梯度离心、CsCI密度梯度离心、RNP非变性凝胶电泳。RNP中的RNA可以釆用上面介绍的Northernblot或引物延伸法进行检测。下面给出的是非变性凝胶电泳分析的步骤。

(1)安装小的垂直凝胶玻璃板，用1.5mm的薄垫片。

(2)制备丙烯酰胺溶液：12.6ml20%丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲叉双丙烯酰胺80:1）、14.4ml50%甘油、2.2ml10XTBE缓冲液、5.8ml水和0.96ml10%APS混合均匀。

(3)将0.36g琼脂糖加入到36ml水中，微波炉融化，等到琼脂糖温度降到大约60℃时将其加入到丙烯酰胺溶液中。

(4)加入35μlTEMED混匀，立即灌胶，凝胶至少凝聚1h。

(5)标准的寡核苷酸靶向的RNaseH切割反应液加上5μlRNP点样缓冲液即可以直接作为电泳样品，为了比较，将一份反应液用75μl水稀释，采用前面所述的方法制备RNA[2“RNA的制备”中步骤(1)~(3)]，将RNA溶解在10μl水中，加入15μl的缓冲液D和5μlRNP点样缓冲液。

(6)室温下用0.3XTBE于60V预电泳30min。

(7)点样，在175V（17V/cm）电泳最少4~5h，直到溴酚蓝染料到达凝胶底部。由于RNP片段大小的变化，可能需要更长的凝胶。凝胶温度应该恒定，温度升高可能导致RNP的变性。

(8)电转移将RNP中RNA从凝胶转移到尼龙膜上，转移需在4℃60V的恒压条件下进行5h，必须确保转移缓冲液温度不会升高，必要时使用冷凝系统，转移后的尼龙膜按以前所述的步骤进行操作[4"RNaseH切割产物——RNA片段的分析”中的（1）“Northernblot”中的步骤④~⑦]。